≡× МЕНЮ

• Радиаторы
• Отопление
• Газоснабжение
• Газопровод
• Водопровод

Вестерн блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting). ОФС.1.7.2.0022.15 Определение подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов методом вестерн-блот Вестерн блоттинг ошибки при выполнении

Скачать методичку

Суть метода. Вестерн-блоттинг (иммуноблотинг, от англ. Blotting — промокание) - современный высокочувствительный аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков с помощью антител.

Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген/антитело (исследуемый белок)». Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моно- или поликлональных антител. В оптимально подобранных условиях Вестерн-блоттингом можно обнаружить белок в количестве менее 1 нг.

Этапы Вестерн-блоттинга:

1. Разделение белков методом SDS-электрофореза. Наиболее распространенным способом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле, в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS ). В присутствии SDS белки подлежащие анализу приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы. Денатурированные белки мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее. Так же на гель наносят маркеры (смесь белков с известными молекулярными массами). Отличия в скорости продвижения (электрофоретической подвижности) приводит к разделению белков на полосы.
2. Перенос белков из геля на мембрану (изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF ) происходит под действием электрического тока. В результате этого процесса белки оказываются в тонком поверхностном слое мембраны, где за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий происходит их связывание с мембраной. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
3. Блокирование. Для того, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с мембраной, последнюю инкубируют в разбавленном растворе белка - обычно используют бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко. Белок из разбавленного раствора связывается с мембраной в тех местах, где нет белковых полос. В результате антитела при их добавлении могут связываться только со специфичными сайтами связывания исследуемых белков. Блокирование позволяет достичь чистого фона и исключить получение ложноположительных результатов.
4. Связывание исследуемого белка с антителами. После блокирования мембраны ее отмывают буфером (3 раза) и последовательно инкубируют с различными антителами методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые, в свою очередь, связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
5. Детекция. Визуализации исследуемого белка достигают путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяют колориметрическим, хемилюминесцентным или флюоресцентным методами детекции. Количество белка оценивают с помощью денситометрии.

Планируется визуализировать и определить количество белка светособирающего комплекса фотосистемы 2 – Lhcb2 из тилакоидов Arabidopsis thaliana .
Все вопросы и предложения присылать по адресу.

Вестерн-блот анализ по тестированию количества кальпастатина включал разделение тканевых белков (30 мкг на дорожку) методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии SDS (Laemmli, 1970) с последующим полусухим переносом полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану (буфер: 48 мМ Трис-HCl, 39 мМ глицин, 0.0375% SDS, 20% метанол, pH 9.2). После инкубации (2 ч, 20°C) мембраны в буфере TBS (50 мМ Трис-HCl-буфер, 150 мМ NaCl, pH 7.5) проводили блокировку сайтов неспецифического связывания 5% раствором обезжиренного молока в буфере TBST (TBS с добавлением 0.1% Tween 20, pH 7.5) в течение 1 ч. Далее мембрану подвергали последовательному экспонированию с поликлональными антителами к кальпастатину (разведение 1: 2500 в буфере TBST; 1 ч) и с антителами к IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой (разведение1: 2000 в буфере TBST; 1 ч); каждый из указанных этапов завершался многократной отмывкой буфером TBST. Мембрану подвергали стандартной обработке системой Immune-Star (Bio-Rad, США).

2.3.6 Другие методы

Концентрацию белка во фракциях определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.

Денситометрия полос на зимограммах и рентгеновской пленке проводилась с помощью стандартной программы “Image J”.

Статистическую обработку данных проводили с применением общепринятых методов вариационной статистики с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни), а также с использованием однофакторного дисперсионного анализа (Коросов, Горбач, 2007).

Глава 3.Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенерации на фоне эстрогенной терапии

Нейродегенерация индуцировалась у крыс линии Вистар старших возрастных групп – 12 и 24 месяцев. Экспериментальное воздействие заключалось в интрацеребральном введении 42-членного фрагмента амилоидного белка-предшественника – Абета(1-42) (экспериментальная модель болезни Альцгеймера), а также сочетанном интрацеребральном введениие бета-амилоидного пептида и интраназальном введении нейропротектора (эстрадиола). Среди животных были выделены: группа контроля – ложно-оперированные (2 μл физраствора в область правого гиппокампа); первая опытная группа – 2 μл раствора пептида Абета(1-42) (соответствуют 5μг пептида) в область правого гиппокампа; вторая опытная группа – после аналогичной инъекции пептида Абета(1-42) ежедневное интраназальное введение 0,1 мг 17-бета-эстрадиола.

Было обнаружено, что в присутствии амилоидогенного пептида в нервной ткани происходит активация кальпаиновой системы, причем степень активации положительно коррелирует с интенсивностью гибели клеток нервной ткани (плотностью нейронов). Регуляция кальпаинов может осуществляться как на уровне синтеза ферментного белка (или отдельных его форм – продуктов разных генов), так и на посттрансляционном уровне за счет процессов аутолиза, связывания с эндогенным ингибитором кальпастатином или с аллостерическим регулятором – кальцием.

Обнаруженное методом казеиновой зимографии увеличение пула аутолизированных кальпаинов (118 кДа) в группе животных №2 отражает активацию кальпаинов in vivo. Наблюдаемая активация m-кальпаина (120 кДа), по-видимому, как и во многих других ситуациях, сопряжена с избытком кальция в цитоплазме. Еще одним подтверждением этого пути регуляции активности кальпаинов служит стабильный уровень их ингибитора – кальпастатина, обнаруженный в нашем исследовании.

Как оказалось, терапия эстрадиолом обращает эффект гиперактивации кальпаинов, при этом снижается как общая активность кальпаинов в нервной ткани, так и активность индивидуальных фракций. В присутствии эстрадиола меньшая доля предшественника кальпаина подвергается аутолизу, а следовательно, активации. Необходимы дальнейшие исследования механизма регуляции активности кальпаинов у экспериментальных животных, в частности, необходимы эксперименты, направленные на установление источника избыточного кальция и поиск средств, предотвращающих эти патологические токи.

Уровень синтеза протеасом в мозговой ткани невысок в сравнении с другими органами и имеет тенденцию к снижению с возрастом (при сравнении показателей у 18, 24 и 30-месячных животных), о чем судили по количеству альфа-1,2,3,5,6,7 субъединиц протеасом, формирующих альфа-кольца коровой 20S частицы, универсальной для 20S и 26S протеасом.

Было подтверждено изменение уровня экспрессии и активности катепсинов в разных зонах мозга у экспериментальных животных. Интрацеребральное введение бета-амилоидного пептида привело в нашем эксперименте к значительному повышению (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Наши данные продемонстрировали значительное влияние бета-амилоида и эстрадиола на когнитивные функции крыс, оцененные с помощью водного лабиринта Морриса. У заранее обученных самок и самцов крыс после введения бета-амилоидного пептида в гиппокамп значительно (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Результаты конфокальной микроскопии срезов мозга показали, что введение бета-амилоидного пептида привело к значительному увеличению уровня его иммунореактивности в тканях как правого, так и левого (в меньшей степени) полушария головного мозга. Эти результаты, наряду с поведенческими данными, свидетельствуют об эффективности введенного препарата амилоидного пептида и служат доказательством репрезентативности выбранной модели болезни Альцгеймера. Последующее введение эстрадиола привело к снижению количества бета-амилоида в мозге крыс почти до контрольного уровня. Сокращение амилоидных депозитов у крыс, получавших эстрадиол, свидетельствует о запуске в нервной ткани неких адаптационных процессов, направленных на их утилизацию.

Механизм нейропротекторной роли эстрадиола пока полностью не понят, хотя отмечен этот феномен давно. Использование эстрадиола в качестве нейропротектора продиктовано несколькими причинами. Во-первых, нейропротективный эффект эстрадиола довольно хорошо известен и описан в литературе (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). Во-вторых, показано, что эстрадиол в полном смысле слова является нейростероидом, так как в мозге имеются все ферменты, необходимые для его синтеза (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). В-третьих, известно, что нейропротективное действие эстрадиола связано с его антиоксидантным (Behl et al., 1997) и антиапоптотическим (Asimiadou et al., 2005) действием, то есть с эффектами, противоположными эффектам пептида Aбета.

Полученные результаты могут свидетельствовать об адаптивной реакции нервной ткани на введение токсичного пептида. В некоторых публикациях указывается на то, что система лизосомальной аутофагии может принимать участие в деградации бета-амилоидного пептида (Nixon, 2007). Вероятно, эстрадиол стимулирует аутофагию белкового материала; об этом свидетельствуют как данные о содержании пептида Aбета в мозговой ткани, так и оценка активности и уровня экспрессии протеиназ лизосом. Методом флюоресцентной иммуногистохимии было установлено снижение количества бета-пептида у крыс, получавших нейропротективную терапию эстрадиолом.

На основании данных, полученных в эксперименте можно сделать следующие выводы. 1. Уровень экспрессии генов лизосомальных протеиназ CtsD, CtsB, CtsL и альфа-субъединиц протеасом и активность кодируемых ими ферментов в коре головного мозга крыс при старении снижается. Напротив, активность кальпаинов у животных старших возрастных групп повышается. 2. Уровень экспрессии и активности катепсина D, а также интенсивность кальций-зависимого протеолиза значительно возрастают в гиппокампе и коре головного мозга крыс после интрацеребрального введения бета-амилоидного пептида, при этом страдает когнитивная функция животных. 3. Введение эстрадиола на фоне бета-амилоидной интоксикации приводит к уменьшению содержания этого пептида в гиппокампе крыс и улучшению биохимических и поведенческих показателей у экспериментальных животных. 4. Фармакологическая активация лизосомальной функции эстрогенами может способствовать удалению Aбета при болезни Альцгеймера; нормализация кальциевого гомеостаза в этой ситуации предотвращает патологическую активацию кальпаиновой системы, а, вместе с тем, и потерю нейронов по кальпаин-зависимым путям клеточной гибели.

Блоттинг (от англ. "blot " - пятно) - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация.

Методы разделения молекул для блоттинга:

• электрофорез в полиакриламидном геле:
o в денатурирующих условиях с добавлением мочевины - разделение коротких одноцепочечных НК;
o в денатурирующих условиях с добавлением натрия додецилсульфата (электрофорез по Лэммли) - разделение белков по молекулярной массе;
o в нативных условиях - разделение белков по трехмерной структуре;
• изоэлектрофокусирование - для разделения белков по изоэлектрической точке (pI);
• двумерный (2D) электрофорез - для разделения белков в двух направлениях - по изоэлектрической точке и по молекулярной массе;
• электрофорез в агарозном геле - разделение НК:
o по длине линейных фрагментов;
o по "суперспирализации" кольцевых молекул;
• тонкослойная хроматография - разделение липидов из липидных комплексов.

Методы переноса:

• диффузия молекул - медленный перенос, часто применяется для липидов;
• капиллярный блоттинг - мембрана прижимается к гелю, поверх нее кладется стопка фильтровальной бумаги, буфер для переноса увлажняет гель и поднимается под действием капиллярных сил, смачивая фильтровальную бумагу и перенося макромолекулы из геля на мембрану; капиллярный блоттинг может осуществляться:
o в камерах с увлажнением геля буфером - "полусухим" переносом;
o в камерах с погружением геля в буфер;

• вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил, создаваемых при смачивании фильтровальной бумаги;
• электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока;
• "пришивание" НК к мембране под действием УФ-облучения или нагрева - для окончательного закрепления на нейлоновых мембранах;
• дот-блоттинг (слот-блоттинг) - нанесение образца производится в виде точки или черточки непосредственно на мембрану без предшествующего разделения молекул в геле или на ТСХ-пластине.

Типы мембран:

• PVDF-мембраны (поливинилиденфторидные);
• NC-мембраны (нитроцеллюлозные);
• нейлоновые мембраны (применяются для НК).

Способы мечения и детекции макромолекул на мембране:

• окрашивание - связывание красителя (ионов серебра, Кумасси, Понсо, этидия бромистого) непосредственно с детектируемыми макромолекулами;
• иммунохимическое мечение - мечение макромолекул происходит за счет специфически связывающихся с ними меченых антител, детекция осуществляется:
o иммуноокрашиванием - антитела метятся красителями, регистрируется поглощение света определенной длины волны;
o иммуноферментно - антитела метятся ферментом, регистрируется количество окрашенного продукта, наработанного в ходе ферментативной реакции (ИФА);
o хемилюминесцентно - антителя метятся репортерным ферментом, который в присутствии субстрата излучает свечение, регистрируется испускание света
определенной длины волны;
o флуоресцентно - антитела метятся флуоресцентной меткой, которая возбуждается светом определенной длины волны, регистрируется испускание света в
более длинноволновой области;
• радиационное мечение - в макромолекулы вводятся радиационные метки (радиоизотопы), детекция осуществляется с помощью:
o авторадиографии (наложением на мембрану фотопленки);
o радиоимаджинга (количественного определения радиационной эмиссии и построения картины взаимного расположения меток);
• гибридизация - связывание нуклеиновых кислот мечеными олигонуклеотидами с комплементарной структурой, детекция, как правило, осуществляется регистрацией испускания радиационного излучения или флуоресценции метки;
• масс-спектрометрия - используется для прямого структурного анализа липидов.

Принятые названия разновидностей блоттинга:

• Саузерн-блоттинг (блоттинг по Саузерну) - по фамилии Эдвина Саузерна, предложившего метод - определение последовательности ДНК в образце и определение числа копий генов в геномной ДНК. Переносу на мембрану предшествует расщепление образца эндонуклеазами рестрикции на фрагменты и их фракционирование электрофорезом в агарозном геле. Анализ на мембране осуществляется гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами известной последовательности;
• нозерн-блоттинг - определение последовательности РНК в образце и изучение генной экспрессии (определение мРНК). Аналогичен блоттингу по Саузерну, но исследуются выделенные из образца молекулы РНК, без расщепления эндонуклеазами. Разделение молекул проводят в агарозном геле с добавлением формальдегида (для денатурации РНК) или в полиакриламидном геле с добавлением мочевины (применяется для анализа микроРНК). Иммобилизация молекул РНК на мембране происходит за счет нагревания под вакуумом или "пришиванием" с помощью УФ-облучения;
• вестерн-блоттинг - белковый иммуноблоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфических белков в образце. Переносу на мембрану предшествует разделение белков в полиакриламидном геле. Анализ белков на мембране осуществляется иммунохимически;
• фар-вестерн блоттинг - белковый блоттинг, используется для определения белок-белковых взаимодействий, аналогичен вестерн-блоттингу, но вместо антител используются другие белки, специфически связывающиеся с исследуемым белком;
• соузвестерн-блоттинг - определение белков, связывающихся с ДНК, и сайтов в молекулах ДНК, с которыми связываются белки - аналогичен вестерн-блоттингу, но после денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле белки отмываются от натрия додецилсульфата в присутствии мочевины и за счет диффузии переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве пробы используют меченые фрагменты ДНК разной длины, полученные расщеплением более крупного исследуемого фрагмента геномной ДНК. Связавшиеся молекулы ДНК затем вымываются из каждого комплекса белок-ДНК и анализируются электрофорезом в полиакриламидном геле;
• истерн-блоттинг - определение посттрансляционных модификаций белков (связанных с ними липидов, гликополисахаридов, фосфатных остатков) - аналогичен вестерн-блоттингу, но используются антитела не к белкам, а к липидам, гликополисахаридам и т.д. Также в качестве проб используются помимо антител другие белковые молекулы связывающиеся с исследуемыми (например, лектин);
• фар-истерн-блоттинг - анализ липидов, разделенных высокоэффективной тонкослойной хроматографией. Перенос на мембрану, как правило, осуществляется за счет диффузии. Регистрация производится прямым масс-спектрометрическим структурным анализом.

Общие.

Все способы постановки Western состоят из следующих этапов:

1) перенос белка из геля на мембрану;
2) забивка неспецифической сорбции;
3) адсорбция I-антител;
4) отмывка;
5) адсорбция II -антител;
6) отмывка;
7) проявление фильтра;

Какой тип мембраны использовать: NC или PVDV (говорят, последняя чувствительнее) зависит только от вашего вкуса. NC мембрана более хрупкая, но при аккуратной работе это незаметно.

По пунктам.

Обрезать ли гель, оставив лишь область, которую вы хотите увидеть на картинке до переноса, после переноса или вообще не обрезать, зависит от вашего желания экономить мембрану и антитела.

Можно в ванночке с гелем.

Но лучше всё накладывать сразу без пузырей.

Или ~3mA на индивидуальную полоску.

Иногда полезно отметить положение границ геля, лунок и т.п.

Можно проконтролировать как много белка осталось в геле после переноса покрасив гель.

Гибридизация.

Фильтр всегда должен быть влажным.

Высохшую PVDF мембрану нужно смачивать метанолом.

Соприкасаться с раствором должна сторонаP(на которую шел перенос).

Гибридизация с а/т проводится в гибридайзере при 26 o C в маленьких цилиндрах или 50ml ЦФ-пробирках. Объём гибридизационного раствора ~3ml (по возможности минимальный, но чтобы мембрана не подсыхала).

Отмывка и забивка: при NT покачивая в ванночке (крышке от типов) V=30-50ml.

Раствор либо выбросить, либо в нем же проводить гибридизацию, только не надо капать на фильтр концентрированные а/т.

Для забивки неспецифики лучше всего использовать сухое молоко, (можно и BSA, но он нам нравится меньше). Разные партии несколько отличаются между собой по интенсивности фона.

Налить гибридизационный раствор в 50ml ЦФ-пробирку, добавить нужное количество а/т, смешать. Проложить фильтр по стенке пробирки, поставить в гибридайзер.

Если вы не знаете в каком разведении работают а/т, то вам придётся определить это экспериментально.

Время взаимодействия с антителами можно увеличивать или уменьшать в зависимости от ваших антител.

Гибридизация проводится в 0.1-0.15М NaCl, снижение ионной силы вызывает сильную неспецифическую гибридизацию.

Очень важно!!! Раствором с антителами можно пользоваться несколько раз (5-7). Достаточно заморозить его после использования на -20 o С. Эта процедура работает по крайней мере для гибридизационного буфера: 1x PBS (without Mg++/Ca++) , 0.3-1.0% Dry milk, Antibodies.

При иммуноокрашивании после иммунопреципитации фон можно убрать преконъюгировав предварительно вторичные антитела с первичными.

Приведённая процедура - не единственная. Варианты:

1. Все делать при NT на качающейся платформе, гибридизация и забивка в целлофановых пакетах (V раствора ~1.5мl, в зависимости от размера фильтра), отмывка в ванночке:
1. забивка: 3% сухое молоко, 1х PBS, 30-40";
2. "I"а/т: 1h 0.3% сухое молоко, 1х PBS, антисыворотка;
3. отмывка 3 раза х 5": 1х PBS, 0.05% Tween-20;
4. "II"а/т: 30" в 1х PBS;
5. отмывка как в п.3.

Несмотря на существенно более низкое содержание сухого молока в гибридизационном буфере для "I"а/т и полное его отсутствие в буфере для "II"а/т этот метод давал чистые картинки. Видимо, успех определялся качеством использованных а/т.

2. Отмывка и забивка проводятся в ванночке. Гибридизация: на стол положить кусок парафильма (больше мембраны), на него - 0.5-1ml гибридизационного раствора с а/т. Положить мембрану стороной (Р) к раствору, избегая пузырей, сверху прикрыть куском парафильма размером с мембрану. Инкубировать 1h.

Этот способ сокращает объём гибридизационной смеси, но может ухудшить качество гибридизации.

Максимум свечения наступает через 4-5" после нанесения раствора (разумная интенсивность свечения сохраняется в течение 15-20").

И в других естественно-научных дисциплинах.

Другие сходные методы используют антитела для определения белков в тканях и клетках посредством иммуноокрашивания и иммуноферментного анализа (ИФА , англ. ELISA ).

Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (англ. George Stark ) в Стэнфорде . Название вестерн блот было дано технике У. Нейлом Бурнеттом (англ. W. Neal Burnette ) и является игрой слов от названия Саузерн блоттинг , - методики определения ДНК , разработанной ранее Эдвином Саузерном. Аналогичный метод определения РНК называется нозерн блоттингом, детекция посттрансляционных модификаций белков называется истерн блоттингом (англ. Eastern blotting ).

Подготовка образца

Образец может быть взят из цельной ткани или из клеточной культуры. В большинстве случаев, твёрдые ткани сначала измельчаются механически с использованием блендера (для образцов большого объёма), с использованием гомогенизатора (меньшие объемы), или обработки ультразвуком . При этом бактерии, вирусы и другие компоненты окружающей среды также являются источником белков.

Гель-электрофорез

Белки разделяются при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Разделение белков можно производить по изоэлектрической точке (pI), молекулярной массе , электрическому заряду или по сочетанию этих параметров.

Наиболее распространенный способ разделения белков - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS ) по Лэммли. SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей, например, дитиотреитол и меркаптоэтанол. Денатурированные полипептиды мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду , при этом белки меньшего размера двигаются быстрее и, таким образом, разделяются в соответствии с молекулярной массой. Концентрация акриламида определяет разрешающую способность геля - чем выше концентрация акриламида, тем лучше разрешение низкомолекулярных белков. Низкая концентрация акриламида улучшает разрешающую способность для высокомолекулярных белков. Также возможно использование двухмерного электрофореза (2-D). В таком случае разделение белков производят в двух направлениях - в соответствии с их изоэлектрической точкой в первом направлении, и в соответствии с молекулярной массой - во втором.

Образцы на гель наносят в карманы. Как правило, одну из «дорожек» оставляют для маркеров молекулярной массы (смеси белков с известными массами). После подачи напряжения белки двигаются в электрическом поле с различной скоростью. Отличия в скорости продвижения - электрофоретической подвижности приводит к разделению белков на полосы (англ. bands ).

Перенос на мембрану

Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF ). Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, уносит с собой белки. Другой метод переноса белков называется электроблоттингом и использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого «промакивания» (от. англ. blotting ) процесса белки удерживаются на тонком поверхностном слое мембраны для детекции. Оба варианта мембран используют из-за их свойства неспецифично связывать белки. Связывание белков основано как гидрофобных взаимодействиях, так и на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком. Нитроцеллюлозная мембрана дешевле PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже выдерживает повторное нанесение меток.

Единообразие и общая эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Coomassie blue или Ponceau S. Coomassie наиболее распространенный из двух, а краситель Ponceau S обладает большей чувствительностью и лучше растворим в воде, что упрощает последующую отмывку и нанесение меток на мембрану.

Блокирование

Как только выбрана мембрана за её способность связывать белки, выбраны антитела и целевой белок, должны быть приняты меры по исключению взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для детекции целевого белка (ибо антитело само по себе белок). Блокирование неспецифичных связываний достигается помещение мембраны в разбавленный раствор белка - обычно бычий сывороточный альбумин (BSA) или нежирное сухое молоко (оба недорогие), с небольшим процентом детергента типа Tween 20. Белок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой белок. Поэтому, при добавлении антител, им (антителам) нет свободного места на мембране, куда бы они могли прикрепиться, кроме сайтов связывания на специфичных целевых белках. Этот фоновый «шум» в окончательном продукте вестерн блота приводит к чистым результатам и исключению ложно-положительных.

Детекция

Во время процесса детекции мембрана «метится» исследуемым белком с модифицированным антителом, которое связано с репортёрным ферментом, который выдерживается на соответствующей подложке, приводя к колориметрической реакции и давая цвет. В силу различных причин, детекция проводится в два этапа, хотя сейчас доступен одношаговый метод детекции для определенных областей применения.

Антитела вырабатывают, воздействуя на класс хозяйских или на культуру иммунных клеток некоторым белком (или его частью).Обычно это часть иммунного ответа, а здесь (в анализе) собранные антитела используются как специфичный и чувствительный инструмент детекции, который напрямую связывается с белком.

После блокирования разведенный раствор первичных антител (обычно между 0.5 и 5 мкг/мл) инкубируется с мембраной и слегка встряхивается. Обычно раствор состоит из забуференного раствора соли с небольшим процентным содержанием детергента, иногда с сухим молоком или BSA. Раствор антител и мембрана могут быть вместе закрыты и инкубированы где угодно от 30 минут до оставления на ночь. Также они могут быть инкубированы при различных температурах, при повышенной температуре наблюдается лучшее связывание - и специфичное (целевого белка, «сигнал1») и неспецифичное («шум»).

После полоскания мембраны для удаления несвязавшихся первичных антител, мембрану выдерживают в других антителах, напрямую связывающихся с класс-специфическими участками первичных антител. Они известны как вторичные антитела и в соответствии с их целевыми свойствами, как правило называются по типу «anti-mouse», «anti-goat», и так далее. Антитела получают из животного источника (или животных - источников культуры гибридом); анти-мышиные вторичные антитела будут связываться с большинством первичных антител, полученных из мышей. Это создает некоторую экономию, позволяя отдельной лаборатории использовать один источник массового производства антител, и ведет к намного более воспроизводимым результатам. Вторичные антитела обычно связывают с биотином или с репортёрным ферментом , таким как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена . Это значит, что несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным и усиливать сигнал.

Наиболее распространенные, связанные с пероксидазой хрена вторичные антитела используются для разрезания хемилюминесцентного агента, и продукт реакции производит люминесцентное излучение пропорционально количеству белка. Лист светочувствительной фотографической пленки помещается напротив мембраны и подвергается действию излучения реакции, создавая изображение полос антител на блоте. Более дешевый, но менее чувствительный подход с использованием 4-хлоронафтольного окрашивания в смеси с 1 % перекисью водорода ; реакция пероксидного радикала с 4-хлоронафтолом дает темно-коричневое окрашивание, которое регистрируется без использования специальной фотографической пленки.

Третий альтернативный метод использует радиоактивную метку вместо фермента, связанного с вторичным антителом, такую как меченный антитело-связывающий белок типа Белка А Staphylococcus с радиоактивным изотопом йода. Другие методы безопаснее, быстрее и дешевле, поэтому радиоактивная детекция используется редко.

Исторически процесс нанесения меток проводится в два этапа, потому что относительно проще произвести первичные и вторичные антитела в раздельных процессах. Это дает исследователям и компаниям огромные преимущества в плане гибкости, и добавляет шаг амплификации в процесс детекции. Учитывая появление высоко-пропускного анализа белка и низкий порог обнаружения, все же наблюдается интерес к развитию системы-в-один-шаг для нанесения меток, которая позволяет процессу проходить быстрее и с меньшими затратами. Она (система-в-один-шаг) требует антител-меток, которые распознавали бы исследуемый белок и одновременно несли маркер для детекции - метки, наиболее доступные для известных «белковых хвостов». Сначала метки инкубируют с мембраной в стиле метода-в-два-шага с первичными антителами, а затем они готовы для прямой детекции после серии промывок.

Анализ

После отмывки несвязавшихся меток, вестерн блот готов к детекции зондов, связавшихся с целевым белком. На практике, не во всех вестернах обнаруживают белки лишь по одному бэнду на мембране. Приблизительный размер вычисляют сравнивая окрашенные бэнды с маркерами молекулярной массы, добавленными при электрофорезе. Процесс повторят с структурными белками, такими как актин или тубулин , которые не меняют между экспериментами. Количество целевого белка зависит от количества контрольного структурного белка между группами. Этот прием обеспечивает коррекцию количества общего белка на мембране в случае ошибки или неполного переноса.

Колориметрическая детекция

Метод колориметрической детекции основан на инкубации вестерн блота с субстратом, который реагирует с репортерным ферментом (таким как пероксидаза хрена , англ. horseradish peroxidase ), «сидящем» на вторичном антителе. Растворимый краситель переходит в нерастворимую форму другого цвета, осаждаясь рядом с ферментом и окрашивая мембрану. Рост пятна ограничивается смыванием растворимого красителя. Уровень количества белка оценивается денситометрически по интенсивности окрашивания или спектрофотометрически .

Хемилюминесцентная детекция

Метод хемилюминесцентной детекции основывается на инкубации нитроцеллюлозной мембраны с субстратом, который люминесцирует после взаимодействия с репортером вторичного антитела. Свет регистрируется фотопленкой или CCD -камерой, которая производит цифровую съемку вестерн блота. Изображение анализируется денситометрически, оценивая относительное количество окрашенного белка и даёт количественный результат в единицах оптической плотности. Новое программное обеспечение позволяет провести дальнейший анализ данных, например, определить молекулярный вес, если использовался соответствующий стандарт.

Радиоактивная детекция

Радиоактивные метки не нуждаются в ферментных субстратах, а позволяют помещать медицинскую радиографическую плёнку напротив вестерн блота, давая ей (плёнке) возможность взаимодействовать с метками и создавая тёмные участки, которые соответствуют полосам иследуемого белка (на изображении справа). Востребованность методов радиоактивной детекции снижается из-за их дороговизны, высокого риска для здоровья и безопасности и альтернатив, предоставляемых ECL.

Флюоресцентная детекция

Флюоресцентные метки возбуждаются светом и излучают более длинноволновый свет, регистрируемый фотосенсорами, такими как CCD -камера, снабженная соответствующими фильтрами эмиссии. Камера делает цифровой снимок вестерн блота, позволяя проводить дальнейший анализ полученных данных, такой как анализ молекулярного веса и количественный вестерн блот анализ.