Поляризованный микроскоп. Поляризационная микроскопия в гистологии
Глоссарий:
- Поляризованный свет - это световые волны, колебания которых распространяются в одном направлении.
- Световая волна - это электрическое и магнитное излучение с плоскостью колебания перпендикулярной плоскости распространения волны.
- Поляризатор (николь I) - это устройство, пропускающее через себя только полностью или частично поляризованный свет. Предназначен для пропускания поляризованного света на(через) исследуемый прозрачный объект и отсекание(рассеивание) неполяризованного (естественного света, искусственного света, в т.ч. излучения осветителя микроскопа). Интенсивность света прошедшего через поляризатор падает пропорционально квадрату косинуса угла между плоскостями поляризации поляризатора и анализатора (закон Малюса):
Где: I - интенсивность до прохождения через поляризатор, I - интенсивность света после прохождения поляризатора, φ - угол между плоскостями поляризации поляризованного света и поляризатора.
- Анализатор (николь II) - устройство, аналогичное поляризатору, но предназначенное для анализа поляризованного света.
Поворот анализатора относительно поляризатора на угол ϕ. Интенсивность света показана красной стрелкой.
- Компенсатор - это устройство для определения количественных характеристик поляризации. Преобразует контрастное видимое изображение в цветное, так как гасит определённые длины волн в белом свете.
- Линейно поляризованный свет - это свет с плоскостью колебания, ограниченной в одном направлении, и распространяющийся в одной плоскости.
- Фаза колебаний световой волны, с математической точки зрения, это аргумент функции световой волны, то есть ωt+φ 0 в функции sin(ωt+φ 0). С физической, это определённое электромагнитное состояние в определённый момент времени.
- Длина волны – расстояние между двумя ближайшими точками, находящимися в одной фазе.
- Отражение - это изменение направления волны. Полным отражением называют изменение угла преломления волны менее 90°.
- Преломление - это изменение направления волны на границе двух сред. Двойное лучепреломление – это расщепление одного луча света в анизотропной среде на две луча.
Рисунок 4 – Преломление лучей в кристалле исландского шпата.
- Дихроизм - это частичное поглощение веществом света, в зависимости от его поляризации.
- Интерференция – это изменение интенсивности света при наложении двух или более световых волн.
- Разность хода световых лучей – это величина, характеризующая замедление скорости света, при прохождении через прозрачное вещество. Измеряется разность хода расстоянием проходимое светом в вакууме за то же время, которое необходимо для прохождения в исследуемом веществе, в исследуемых точках пространства.
- Коноскопия – это метод изучения оптических свойств анизотропных объектов в сходящихся лучах поляризованного света. При коноскопии ведётся наблюдения за изменением интерференционной картины при повороте анализатора. Вращая анализатор и поляризатор, друг относительно друга, исследователь наблюдает в микроскоп коноскопические фигуры, состоящие из изогир (это тёмные полосы, соответствующие направлению колебаний световых волн в поляризаторе) и изохром (это полосы разных интерференционных цветов, которые соответствуют направлениям движения лучей в кристалле с одинаковой разностью хода).
- Ортоскопия – это метод изучения оптических свойств анизотропных объектов в параллельных лучах поляризованного света.
- Плеохроизм – изменение наблюдаемой окраски некоторых анизотропных объектов при изменении угла наблюдения (изменение цвета кристаллов при повороте столика).
Поляризационный микроскоп - это микроскоп, предназначенный для исследования двойного лучепреломления поляризованного света, проходящего через анизотропную среду
Первый поляризационный микроскоп был сконструирован в 1863 году Генри Клифтоном Сорби и отличался от привычного нам оптического микроскопа, двумя призмами Николя, установленными в оптическом пути. Призма Николя пропускает через себя свет только в одном направлении и в одной плоскости, то есть плоско поляризованный свет, остальной свет, попавший в эти призмы полностью отражается и рассеивается. Эти призмы конструктивно ничем друг от друга не отличаются и выполняют роль поляризаторов (анализатора и поляризатора). Когда плоскость поляризации анализатора повёрнута на 90º, относительно плоскости поляризации поляризатора, исследователь наблюдает поляризационную картину двулучепреломляющего объекта, а все объекты, не обладающие двойным лучепреломлением - затемнены. В современных микроскопах, для получения большего количества информации могут использоваться ДИК призмы (совмещение рельефа с поляризационной картиной, для изучения неокрашенных образцов), компенсаторы (для количественной поляризации), круглый столик (для изучения плеохроизма) и простые поляроиды для несложных наблюдений (например в биологии и медицине).
Наиболее часто поляризация применяется в икроскопах для кристалографии, где свойства анизотропных объектов могут быть определены с помощью коноскопии и ортоскопии. Обратите внимание на сходство и различие коноскопии и ортоскопии: световой пучок, проходит через поляризатор (1), ограничивается апертурной диафрагмой (2), проходит через линзы конденсора (3); анализатор (который поворачивает исследователь) (8) и компенсаторы (7).
Рисунок 1 – Схема поляризационного микроскопа при: а) Ортоскопии б) Коноскопии
Условные обозначения: 1 - поляризатор, 2,6 - диафрагмы; 3 - конденсор; 4 - препарат; 5 - объектив; 7 - компенсатор; 8 - анализатор; 9 - линза Бертрана; 10 - фокальная плоскость окуляра; 11 - окуляр.
Наблюдаемая картина состоит из коноскопических фигур. коноскопические фигуры – состоят из изогир (это тёмные прямые или изогнутые полосы, в которых направления колебаний параллельны главным сечениям николей) и изохром (это полосы, окрашенные в различные интерференционные цвета. Каждая полоса соответствует направлениям лучей, образовавшихся при двулучепреломлении, и имеющим одинаковую разность хода).
Приведём пример: в пластинках одноосного кристалла, вырезанного перпендикулярно оптической оси, мы увидим изогиру в форме креста и концентрические кольца изохромы см. рис. 5.
Рисунок 5 – А) Коноскопические фигуры одноосного минерала кальцита Б) Двуосного минерала флогопита со вставленным компенсатором.
По характеру полученной интерференционной картины проводится измерение величины двойного лучепреломления, углов поворота плоскости поляризации, углов погасания, определение количества оптических осей и других характеристик. Все эти характеристики дают понять какой кристалл наблюдает исследователь, его строение. Для минералогии и кристаллографии сконструированы такие микроскопы как BX53P и H600P. Они оснащаются лучшей оптикой, свободной от напряжений и компенсаторами, изготовленными на современном оборудовании, исключающим люфт и зазоры при их установки в микроскоп.
Двулучепреломление применяется не только в кристаллографии, но и в медицине, биологии, криминалистике и металлографии, потому как исследователям важно быстро и точно выделять витамины, кислоты, минералы, напряжения в изотропных объектах, неметаллические включения в исходном образце и другие. Например, микроскопы для гистологии и цитологии оснащаются поляризаторами для выявления разного рода объектов. Круглые объекты с диаметром около 2,4 мкм, липоиды и капли, при скрещенных поляризаторах образуют интерференционную картину мальтийский крест. Не все вещества обладают одинаковыми свойствами лучепреломления при разных температурах, так, например, можно выделить 1) вещества приобретающие анизатропные свойства при охлаждении и теряющие их при нагревании: холестерин и его эфиры 2) не теряющие своих анизатропных свойств при нагревании: цереброзиды, фосфатиды, миелины. Такая изменчивость свойств обусловлена способностью вещества поддерживать кристаллическую структуру, т.к. именно она обуславливает двулучепреломление. Наблюдая анизатропные объекты в поляризационном микроскопе и определяя их концентрацию, можно диагностировать такие заболевания как: артрит, атеросклероз, липоидурия, цилинурия и липидоз по свечению липидов при скрещенных поляризаторах, а также подагру, мочекаменную болезнь, селикоз и асбестос по кристаллам мочевины, двуокиси кремния и асбестовым волокнам соответственно. Для гистологии и цитологии разработан микроскоп BX46, который оснащён низким столиком, мощным осветителем и регулируемый по высоте тубус, который избавит спину исследователя от затекания.
Окраску отличную от изотропных объектов, в поляризованном свете имеют: крахмал, целлюлоза, некоторые кислоты, витамин С, поэтому микроскопы для фармакологии и фармацевтики так же должны оснащаться поляризаторами. Фармакологический микроскоп, это и CX43, и BX43, и другие модели, потому что исследований в этой области с каждым годом всё больше,а новые объекты исследований требуют иного подхода.
В криминалистике важно отличить вкрапления зёрен кварца и других минералов от органики и других материалов, которые можно найти на месте преступления, поэтому микроскоп должен обязательно быть оснащён отражённым светом, чтобы рассматривать и непрозрачные объекты. Для криминалистики подойдёт микроскоп BX53M , так как он оснащается не только мощным источником проходящего света, но и таким же мощным осветителем отражённого света, а провставки для увеличения рабочего расстояния микроскопа, позволят проводить исследования очень больших объектов не проводя долгой предварительной подготовки.
В металлографии тоже применяются поляризационные микроскопы, но для подобных исследований достаточно знать наличие или отсутствие анизатропных объектов, а так же их пространственное распределение. Именно для классификации и подсчёта таких объектов, в металлографии можно использовать микроскопы VHX6000, BX53P с установленным Stream.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т. е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны, или при отражении от них.
В оптически изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах она меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях -- отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и вызывают положительное двойное преломление света .
Темнопольная микроскопия
При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).
Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы. Так как апертура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.
Поляризационная микроскопия является одним из мощных методов морфологических исследования структуры и свойств препаратов. Поляризационная микроскопия позволяет изучать свойства гистологических структур, обладающих способностью двойного лучепреломления.
Для реализации метода поляризационной микроскопии можно дооснастить любой микроскоп. Микроскоп дооснащяется двумя поляризационными фильтрами: первый помещают непосредственно под конденсором, второй помещают между объективом и глазом исследователя. Поворотом поляризатора добиваются затемнения поля зрения. Помещают препарат. Вращают препарат на предметном столике до появления ярко светящихся структур. Свечение появляется в тот момент, когда ось двулучепреломляющего объекта будет находиться под углом 45° к плоскости поляризации.
Ранее для поляризационной микроскопии использовались поляризационные фильтры с линейной поляризацией. В новой методике изучалась возможности диагностики препаратов с использованием поляризационных фильтров с циркулярной поляризацией. Оказалось, что изображения, полученные с помощью циркулярных фильтров, несут гораздо больше информации и позволяют выявлять более тонкую структуру тканей и клеток.
Исследования в поляризованном свете можно проводить на замороженных или парафиновых срезах после депарафинизации, неокрашенных и окрашенных, заключенных в различные среды. Блоки ткани следует вырезать и ориентировать таким образом, чтобы мышечные волокна интересующего слоя миокарда были срезаны продольно.
Миофибриллы в поляризованном свете обнаруживают характерную поперечную исчерченность, связанную с чередованием, анизотропных (А) и изотропных I - дисков. Диски А обладают ярко выраженным положительным двулучепреломлением и кажутся светлыми в поляризованном свете (в обычном свете они темные), тогда как I - диски почти полностью лишены способности к двулучепреломлению и в поляризованном свете выглядят темными (в обычном свете - светлые).
С помощью поляризационной микроскопии удобно выявлять наиболее универсальные повреждения мышечных волокон миокарда и скелетных мышц - контрактурные повреждения (нарушение поперечной исчерченности кардиомиоцитов - одно из ранних признаков повреждения миофибрилл).
Принято выделять 3 стадии этих повреждений:
I стадия - усиливается анизотропия на отдельных участках мышечных волокон. II
стадия - А-диски с повышенной анизотропией сближаются, вследствие чего толщина 1-дисков уменьшается. III
стадия - А-диски сливаются в сплошной анизотропный конгломерат.
Наряду с контрактурными повреждениями поляризационная микроскопия
позволяет идентифицировать еще один тип поражения поперечнополосатых мышечных волокон - гиперрелаксацию саркомеров, свойственную в большой мере ишемии миокарда .
Простота поляризационного метода позволяет с минимальными затратами резко повысить достоверность диагностики наличия инфаркта миокарда.
По поводу поляризационного микроскопа. Ситуация состоит в том, что практически из любого микроскопа можно сделать поляризационный. Используются два поляризационных фильтра (покупаемых в фотомагазине) - один помещается над осветителем, а второй помещается между препаратом и объективом.
Создан справочный CD-ROM - «Поляризационная микроскопия». На диске собрано большое количество работ и материалов по применению поляризационной микроскопии.
Кроме того, создан специализированный комплекс - автоматизированное рабочее место судмедэксперта. В состав комплекса входят - микроскоп поляризационный Nikon E200, цифровая камера с 8 млн элементов, адаптеры и программное обеспечение.
Список литературы: 1.
Кактурский Л.В. Поляризационная микроскопия. В кн. Микроскопическая техника. - М.: Медицина, 1996. 2.
Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А. Применение поляризационной микроскопии для гистологической диагностики ранних стадий ишемических и метаболических повреждений миокарда // Cor et vasa. - 1977 - Vol. 19. - № 1. - P. 28-33 3.
Непомнящих Л.М. Морфогенез важнейших общепатологических процессов в сердце. - Новосибирск: Наука, 1991. - 352 с. 4.
Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Непомнящих Л.М. Очаговые повреждения и инфаркт миокарда. Световая, поляризационная и электронная микроскопия. - Новосибирск, 1980.
Еще по теме Колтовой Н.А. НОВЫЙ МЕТОД ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФАРКТА МИОКАРДА:
- ВОПРОС 252: Какие недостатки в профессиональной деятельности медицинских работников могут стать поводом для возбуждения уголовного или гражданского дела?
- Кирилов В.А., Бахметьев В.И. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИДА ВНЕШНЕГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ РАЗРУШЕНИЯ ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ
- Мишин Е.С., Подпоринова Е.Э., Праводелова А.О. ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПОДЪЯЗЫЧНОЙ КОСТИ, ГОРТАНИ И ТРАХЕИ ПРИ ТУПОЙ ТРАВМЕ ШЕИ
Е. Темнопольная микроскопия.
18. Микроскоп состоит из оптических и механических частей. Что относят к оптическим частям?
А. Тубус, окуляр, конденсор
В. Револьвер, макро- и микровинт, зеркало
С. Револьвер, окуляр
Д. Окуляр, конденсор, объектив
Е. Тубус, окуляр, револьвер
19. При использовании ультрафиолетовых лучей, как источник света, разрешающая способность микроскопа увеличивается. В каких микроскопических приборах используется данный источник света?
А. Темнопольный и люминесцентный
В.Люминесцентный, ультрафиолетовый
С. Световой и электронный
Д.Фазово-контрастный, ультрафиолетовый
Е.Поляризационный, ультрафиолетовый
20. Микроскоп состоит из механических и оптических частей. В каких деталях микроскопа есть диафрагма?
А. Окуляр и объектив
В. Окуляр и конденсор
С. Тубус и окуляр
Д. Объектив и конденсор
Е. Тубус, объектив, окуляр
21. В эксперименте использовались живые объекты, в которых необходимо определить ряд химических компонентов, используя витальное наблюдение. Какой микроскопический метод исследования будет использован?
А. Фазово-контрастная микроскопия
В. Электронная микроскопия
С. Флюоресцентная микроскопия
Е Темнопольная микроскопия.
22. При гистологическом исследовании клетки использовали люминофоры. Какой вид микроскопии использован в данном случае?
А. Световая микроскопия
В. Электронная микроскопия
С. Флюоресцентная микроскопия
Д. Поляризационная микроскопия
Е. Темнопольная микроскопия.
23. Перед исследователем поставлена задача получить пространственное представление о структурах изучаемого объекта. С каким микроскопическим прибором будет работать специалист?
А. Ультрафиолетовая микроскопия,
В. Фазово-контрастная микроскопия,
С. Просвечивающая электронная микроскопия,
Д. Сканирующая электронная микроскопия,
Е. Поляризационная микроскопия
24. В качестве источника света используются ртутно-кварцевые лампы. Какова разрешающая способность микроскопа при таком источнике света?
25. Разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны источника света. Какова разрешающая способность светового микроскопа?
26. Перед началом исследования гистологического препарата необходимо равномерно осветить поле зрения. Какие части микроскопа для этого используют?
А. Микро- и макровит
В. Конденсор и зеркало
С. Тубус и тубусодержатель
Д. Тубус и окуляр
27. Перед исследователем поставлена задача изучить ультра-микроскопическое строение плазмолеммы эритроцита. Какой микроскопический прибор будет использован?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
28. При изучении скелетной мышечной ткани необходимо определить изо- и анизотропные структуры ткани. Какой вид микроскопии будет использован?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрамикроскопический
29. Разрешающая способность люминесцентного микроскопа зависит от длины волны источника света. Чему она равна?
А. 0,1 мкм С. 0,4 мкм
В. 0,2 мкм Д. 0,1 нм
30. В клинической лаборатории для изучения общего анализа крови используются микроскопические исследования. Какой микроскоп необходим для этого?
А. Световой,
В. Фазово-контрастный,
С. Электронный,
Д. Поляризационный,
Е. Ультрафиолетовый.
31. Для исследования представлен живой объект, обладающий природной люминесценцией. Какой вид микроскопии необходимо использовать при данном исследовании?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
32. В результате биопсии получен материал опухолевых клеток. Необходимо изучить их ультрамикроскопическое строение. Какой вид микроскопии используют при данном исследовании?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
ТЕМА 2: ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
Основные принципы приготовления препаратов для световой и электронной микроскопии, взятие материала (биопсия, игловая пункционная биопсия, аутопсия). Фиксация, обезвоживание, уплотнение объектов, приготовление срезов на микротомах и ультрамикротомах. Виды мипрепаратов - срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф. Окрашивание и контрастирование препаратов. Понятие о гистологических красителях.
Микроскопическая техника.
Главные этапы цитологического и гистологического анализа:
Выбор объекта исследования
Подготовка его для изучения в микроскопе
Применение методов микроскопирования
Качественный и количественный анализ полученных изображений
Методы, применяемые в гистологической технике:
1. Прижизненные.
2. Посмертные.
I ПРИЖИЗНЕННЫЕ МЕТОДЫ
Целью прижизненных исследований является получение информации о жизнедеятельности клетки: движение, деление, рост, дифференцировка, взаимодействие клеток, продолжительность жизни, разрушение, реактивные изменения под действием различных факторов.
Исследование живых клеток и тканей возможно вне организма (in vitro) или внутри организма (in vivo).
А. Исследование живых клеток и тканей в культуре (in vitro) –
Метод культивирования
Различают: а)суспензионные культуры (клетки, взвешенные в питательной среде), б)тканевые, в)органные, г)монослойные.
Метод культивирования ткани вне организма является самым распространенным. Культивировать ткань можно в специальных прозрачных герметически закрытых камерах. В стерильных условиях в камеру помещают каплю питательной среды. Наилучшей питательной средой является плазма крови, к которой добавляют эмбриональный экстракт (вытяжка из тканей зародыша, содержащая большое количество веществ, стимулирующих рост). Туда же помещают кусочек органа или ткани (не более 1 мм3), которые необходимо культивировать.
Выдерживать культивируемую ткань следует при температуре тела организма, ткань которого взята для исследования. Так как питательная среда быстро приходит в негодность (в ней накапливаются продукты распада, выделяемые культивируемой тканью), то каждые 3-5 дней ее нужно менять.
Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток между собой, а также с вирусами и микробами. Культивирование эмбриональных тканей позволило изучить развитие кости, хряща, кожи и др.
Особую значимость метод культивирования имеет для проведения экспериментальных наблюдений на клетках и тканях человека, в частности для определения пола, злокачественного перерождения, наследственных заболеваний и др.
Недостатки метода:
1. Главным недостатком этого метода является то, что ткань либо орган исследуется в отрыве от организма. Не испытывая нейрогуморального влияния организма, она теряет присущую ей дифференцировку.
2. Необходимость частых пересадок (при длительном культивировании).
3. Одинаковый коэффициент лучепреломления тканей.
Похожая информация.
