Филаменты клетки. Белки промежуточных филаментов
Кроме микротрубочек, к фибриллярным компонентам цитоплазмы эукариотических клеток относятся микрофиламенты (microfilamenti) толщиной 5-7 нм и так называемые промежуточные филаменты, или микрофибриллы (microfibrillae), толщиной около 10 нм.
Микрофиламенты встречаются практически во всех типах клеток. По строению и функциям они бывают разные, однако отличить их морфологически друг от друга трудно. Располагаются микрофиламенты в кортикальном слое цитоплазмы, непосредственно под плазмолеммой, пучками или слоями. Их можно видеть в псевдоподиях амеб или в движущихся отростках фибробластов, в микроворсинках кишечного эпителия. Микрофиламенты часто образуют пучки, направляющиеся в клеточные отростки.
Сеть микрофиламентов выявлена в большинстве клеток. Они отличаются по химическому составу. В зависимости от их химического состава они могут выполнять функции цитоскелета и участвовать в обеспечении движения. Эта сеть - часть цитоскелета. С помощью иммунофлюоресцентных методов четко показано, что в состав микрофиламентов кортикального слоя и пучков входят сократительные белки: актин, миозин, тропомиозин, а-актинин. Следовательно, микрофиламенты не что иное, как внутриклеточный сократительный аппарат, обеспечивающий не только подвижность клеток при активном амебоидном их перемещении, но, вероятно, и большинство внутриклеточных движений, таких как токи цитоплазмы, движение вакуолей, митохондрий, деление клетки.
Промежуточные филаменты, или микрофибриллы, тоже белковые структуры. Это тонкие (10 нм) неветвящиеся, часто располагающиеся пучками нити. Характерно, что их белковый состав различен в разных тканях. В эпителии, например, в состав промежуточных филаментов входит кератин. Пучки кератиновых промежуточных филаментов в эпителиальных клетках образуют так называемые тонофибриллы, которые подходят к десмосомам. В состав промежуточных филаментов клеток мезенхимальных тканей (например, фибробластов) входит другой белок - виментин. Для мышечных клеток характерен белок десмин, в нервных клетках в состав их нейрофиламентов также входит особый белок.
Роль промежуточных микрофиламентов скорее всего опорно-каркасная, однако эти фибриллярные структуры не так лабильны, как микротрубочки.
37-38. Химический состав и ультраструктура микрофиламентов и микротрубочек. (См. 36)
39. Особенности химического состава и супрамолекулярной структуры промежуточных филаментов. Промежуточные филаменты названы так потому, что их диаметр составляет около 10 нм, что является промежуточной величиной между диаметром микрофиламентов (6 нм) и микротрубочек (25 нм). В отличие от микрофиламентов и микротрубочек они являются не молекулярными полимерами, а поликонденсатами фибриллярных мономеров. Промежуточные филаменты обнаружены во всех клетках животных, но особенно много их в покровном эпителии, нервной и мышечных тканях.
В центральной части молекулы белков промежуточных филаментов содержится одинаковая аминокислотная последовательность из 130 остатков, формирующая a-спираль. Тем не менее, эти белки обладают выраженной тканевой специфичностью, которая определяется концевыми участками их молекул. Сборка филаментов происходит путем упорядоченной конденсации a-спиральных структур.
Белки промежуточных филаментов принадлежат к одной из четырех различных групп – кератинам, белкам мезенхимных клеток, белкам нейрофибрилл и ламинам .
Кератины представляют собой семейство фибриллярных белков с молекулярной массой 40–70 кД, специфичных для эпителиальных клеток.
К белкам нейрофиламентов относятся три полипептида с молекулярной массой 68, 145 и 220 кД. Они вместе с микротрубочками входят в состав характерных для нервных клеток структур – нейрофибрилл, которые участвуют в формировании системы внутриклеточного транспорта в теле нейрона и его отростках.
Промежуточные филаменты цитоплазмы локализуются в основном вокруг клеточного ядра, а также образуют пучки, идущие от ядра на периферию клетки. Распределение промежуточных филаментов в клетке в значительной степени совпадает с распределением микротрубочек, что отражает их совместное участие во внутриклеточных транспортных системах.
В отличие цитоплазматических белков, образующих фибриллы, локализованные в клеточном ядре ламины A, B и C (молекулярная масса 60-70 кД) собраны в прямоугольные решетки. Сформированный ими остов, или ядерный матрикс, контактирует с внутренней мембраной нуклеолеммы, обеспечивая поддержание размеров и формы клеточного ядра. Ядерный матрикс из ламинов служит также опорной структурой для хромосом. При митозе или мейозе ламины фосфорилируются киназами клеточного деления, что приводит к их деполимеризации и распаду нуклеолеммы на отдельные рассеянные по цитоплазме пузырьки. В конце деления активируются фосфатазы, обеспечивающие полимеризацию ламинов и восстановление ядерного матрикса и нуклеолеммы.
40.Актин и ассоциированные с ним белки. Молекулярные механизмы сокращения актиномиозиновых комплексов.
Есть пять основных мест, где может быть приложено действие актин-связывающих белков. Они могут связываться с мономером актина; с «заостренным», или медленно растущим, концом филамента; с «оперенным», или быстро растущим, концом; с боковой поверхностью филамента; и наконец, сразу с двумя филаментами, образуя поперечную сшивку между ними. В дополнение к пяти указанным типам взаимодействия актин-связывающие белки могут быть чувствительны или нечувствительны к кальцию. При таком разнообразии возможностей вряд ли покажется удивительным, что было обнаружено множество актин-связывающих белков и что некоторые из них способны к нескольким типам взаимодействия.
Белки, связывающиеся с мономерами, подавляют формирование затравок, ослабляя взаимодействие мономеров друг с другом. Эти белки могут уменьшать, но могут и не уменьшать скорость элонгации - это зависит от того, будет ли комплекс актина с актин-связывающим белком способен присоединяться к филаментам. Профилин и фрагмин - чувствительные к кальцию белки, взаимодействующие с актиновыми мономерами. Оба нуждаются в кальции для связывания с актином. Комплекс профилина с мономером может надстраивать предсуществующие филаменты, а комплекс фрагмина с актином нет. Поэтому профилин в основном ингибирует нуклеацию, тогда как фрагмин подавляет и нуклеацию, и элонгацию. Из трех нечувствительных к кальцию взаимодействующих с актином белков два - ДНКаза I и белок, связывающийся с витамином D, - функционируют вне клетки. Физиологическое значение их способности связываться с актином неизвестно. В головном мозге есть, однако, белок, который, связываясь с мономерами, деполимеризует актиновые филаменты; его деполимеризующее действие объясняется тем, что связывание мономеров приводит к снижению концентрации доступного для полимеризации актина.Молекулы миозина и актина, взаимодействуя друг с другом, образуют актомиозиновый комплекс, в котором и разыгрываются основные события, приводящие к созданию силы, вызывающей сокращение мышцы. В покоящейся мышце миозиновые мостики не проявляют АТФазной активности, поскольку тропомиозин и белки тропонинового комплекса препятствуют взаимодействию головок миозина с нитью актина. Активация актомиозинового комплекса инициируется ионами Са2+. Концентрация Са2+ в цитоплазме мышечной клетки в покое (расслабленная мышца) составляет менее 0,1 мкм, что гораздо ниже концентрации Са2+ в межклеточной жидкости. Это обусловлено работой специального фермента – кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума, который, используя энергию молекул АТФ (АТP), перекачивает Са2+ из цитоплазмы в специальные цистерны. Под действием нервного импульса ионы Са2+ выходят из кальциевых цистерн и связываются с ТnC. Это приводит к структурным изменениям остальных белков тропонинового комплекса. В конечном итоге изменяется положение тропомиозина относительно нити F-актина, и теперь головка миозина может связываться с актином. Тянущая сила, вызывающая смещение миозина вдоль нитей актина, возникает за счет структурных изменений в каталитическом центре миозина после гидролиза молекулы АТФ. Миозин напоминает механическое устройство, в котором головка и шейка миозинового мостика играют роль своеобразного рычага, позволяющего увеличить амплитуду смещения миозинового хвоста. Этот рычаг одним из своих концов опирается на актиновую нить, другой конец рычага соединен с хвостом молекулы миозина (рис. 3). После гидролиза АТФ и диссоциации Фн (Рi) и AДФ (ADP) из каталитического центра в головке миозина происходят структурные перестройки, в результате которых зацепленная за нить актина головка миозина поворачивается на угол a = 30–40°, увлекая за собой хвост миозина (рис. 3). Так возникает сила, вызывающая скольжение толстых нитей миозина вдоль нитей актина.
41. Ультраструктура диктиосом и их функции. Аппарат Гольджи представлен мембранными структурами, собранными вместе в небольшой зоне. Отдельная зона скопления этих мембран является диктиосомой. В диктиосоме плотно друг к другу (на расстоянии 20-25 нм) расположены в виде стопки плоские мембранные мешки, или цистерны, между которыми располагаются тонкие проПо данным электронно-микроскопического исследования, ультраструктура комплекса Гольджи включает три основных компонента:1. Система плоских цистерн. 2. Система трубочек. 3. Крупные и мелкие пузырьки. Все три компонента аппарата Гольджи взаимосвязаны и могут возникать друг из друга. В клетках различных органов и тканей компоненты аппарата Гольджи развиты неодинаково.Функции аппарата Гольджи: 1)синтез полисахаридов и гликопротеинов (гликокаликса, слизи);2)модификация белковых молекул (терминальное гликозилирование – включение углеводных компонентов; фосфорилирование – добавление фосфатных групп; ацилирование – добавление жирных кислот; сульфатирование – добавление сульфатных остатков и т.д.;3)конденсация секреторного продукта (в конденсирующих вакуолях) и образование секреторных гранул;4)сортировка белков на транс-поверхности;5)упаковка секреторных продуктов в мембранные структуры.
42. Включения. Помимо мембранных и немембранных органелл в клетках могут быть клеточные включения, представляющие собой непостоянные образования, то возникающие, то исчезающие в процессе жизнедеятельности клетки.Основное место локализации включений - цитоплазма, но иногда они встречаются и в ядре.По характеру все включения - это продукты клеточного метаболизма. Они накапливаются главным образом в форме гранул, капель и кристаллов. Химический состав включений очень разнообразен.Липоиды обычно откладываются в клетке в виде мелких капель. Большое количество жировых капель встречается в цитоплазме ряда простейших, например инфузорий. У млекопитающих жировые капли находятся в специализированных жировых клетках, в соединительной ткани. Часто значительное количество жировых включений откладывается в результате патологических процессов, например при жировом перерождении печени. Капли жира встречаются в клетках практически всех растительных тканей, очень много жира содержится в семенах некоторых растений.Включения полисахаридов имеют чаще всего формулу гранул разнообразных размеров. У многоклеточных животных и простейших в цитоплазме клеток встречаются отложения гликогена. Гранулы гликогена хорошо видны в световом микроскопе. Особенно велики скопления гликогена в цитоплазме поперечнополосатых мышечных волокон и в клетках печени, в нейронах. В клетках растений из полисахаридов наиболее часто откладывается крахмал. Он имеет вид гранул различной формы и размеров, причем форма крахмальных гранул специфична для каждого вида растений и для определенных тканей. Отложениями крахмала богата цитоплазма клубней картофеля, зерен злаков; каждая крахмальная гранула состоит их отдельных слоев, а каждый слой, в свою очередь, включает радиально расположенные кристаллы, почти невидимые в световой микроскоп.Белковые включения встречаются реже, чем жировые и углеводные. Белковыми гранулами богата цитоплазма яйцеклеток, где они имеют форму пластинок, шариков, дисков, палочек. Белковые включения встречаются в цитоплазме клеток печени, клеток простейших и многих других животных.
Промежуточные филоменты – прочные и устойчивые в химическом отношении белковые нити толщиной около 10 нм (что является промежуточным значением между толпщной микротрубочек и микро-филаментов). Они встречаются в клетках разных тканей (см. ниже) и располагаются в виде трехмерных сетей в различных участках цитоплазмы, окружают ядро, входят в состав десмосом и полудесмосом эпителиальных клеток (в плазмолемме которых они закреплены посредством трансмембранных белков), лежат по всей длнне отростков нейронов. Промежуточные филаменты образованы нитевидными белковыми молекулами, сплетенными друг с другом наподобие каната.
Функции промежуточных филаментов изучены недостаточно; установлено, однако, что они не влияют ни на движение, ни на деление клетки. К их основным функциям относятся:
(1)структурная – поддерживающая и опорная, обеспечение распределения органелл по определенным участкам цитоплазмы;
(2) обеспечение равномерного распределения сил деформации между клетками ткани, что препятствует повреждению отдельных клеток (благодаря связи промежуточных филаментов с трансмембранными белками десмосом и полудесмосом);
(3) участие в образовании рогового вещества в эпителии кожи; в эпителиальных клетках связываются с другими белками и образуют непрошщаемые барьеры (роговые чешуйки), являются главным компонентом волос и ногтей;
(4) поддержание формы отростков нервных клеток и фиксация трансмембранных белков (в частности, ионных каналов);
(5) удержание миофибрилл в мышечной ткани и прикрепление к плазмолемме, что обеспечивает их сократительную функцию.
Очевидно, что функции, отмеченные цифрами (2)-(5), служат частными проявлениями более общей структурной функции (1) в различных тканях.
В поврежденной клетке сеть промежуточных филаментов (в отличие от других компонентов цитоскелета) спадается и концентрируются вокруг ядра, связывая поврежденные органеллы и белковые агрегаты. Формируется своеобразная структура, которая наподобие кокона концентрирует поврежденные компоненты клетки для последующего уничтожения путем их внутриклеточного переваривания. В ходе восстановления структуры и функции клетки после повреждения сеть промежуточных филаментов вновь развертывается по всей цитоплазме. В отличие от микрофиламентов и микротрубочек, для образования промежуточных филаментов не требуется АТФ, причем они не подвергаются постоянной сборке и диссоциации, а представляют собой менее лабиль-ные и сравнительно устойчивые структуры.
Распределение промежуточных филаментов различных классов в клетках и тканях человека
Классы промежуточных филаментов и их идентификация.
Несмотря на то, что строение промежуточных филаментов в клетках различных типов сходно, они существенно различаются по своей молекулярной массе и химической природе, что может быгь продемонстрировано иммуноцитохимическими методами с антителами к промежуточным филаментам различных классов. Различают 6 основных классов промежуточных филаментов (см. выше). В цитоплазме большинства клеток содержится лишь один их класс; в части клеток выделяются два класса, из которых один является основным.
Идентификация классов промежуточных филаментов имеет важное значение в диагностике опухолей для выявления тканевой принадлежности опухолевых клеток, что может определить выбор лечения и прогноз. Наибольшее диагностическое значение имеет выявление цитокератинов, десмина и глиального фибриллярного кислого белка, которые служат маркерами опухолей эпителиального, мышечного и глиального происхождения. Менее отчетливые результаты дает обнаружение виментина, который экспрессируется и коэкспрессируется (экспрессируется в сочетании с белками других классов промежуточных филаментов) многими типами клеток. Существенную информацию о степени поражения эпителия можно получить путем определения экспрессии молекулярных форм кератинов, специфичных для клеток конкретной локализации и уровня дифференцировки. Таким путем можно установить, например, ранние предраковые изменения в эпителии, не выявляемые стандартными морфологическими методами.
Промежуточные филаменты (ПФ) - элементы цитоскелета, состоящие из сходных по строению и функциям белков. Своё название они получили из-за того, что их диаметр - около 10 нм - промежуточный между диаметром микрофиламентов и микротрубочек. К белкам ПФ относятся ламины, из которых состоит внутренняя выстилка ядерной оболочки, и цитоплазматические белки, различающиеся в разных клетках. Ламины есть у большинства эукариот, цитоплазматические ПФ - только у некоторых животных, причем не во всех тканях. Так, ламины есть у нематод, моллюсков и позвоночных, но не найдены у членистоногих и иглокожих.
Сборка и разборка промежуточных филаментов
Сборка промежуточного филамента из молекул кератина
Две молекулы кератина (или иного белка ПФ), имеющие вытянутую форму, закручиваются друг вокруг друга, образуя гомо- или гетеродимер. При этом они направлены "голова к голове " (NH2-концы обеиз молекул смотрят в одну и ту же сторону). Затем два таких димера объединяются в тетрамер «головой к хвосту». Из таких тетрамеров собираются протофиламенты, а затем 8 протофиламентов объединяются в ПФ диаметром около 10 нм. Тетрамеры удерживаются вместе в основном за счет гидрофильно-гидрофобных взаимодействий. Между отдельными ПФ образуются дисульфидные мостики; это придаёт сетям из ПФ особую прочность и делают их малорастворимыми. Сети из ПФ сохраняют целостность даже после гибели клетки (из таких заполненных кератином мертвых клеток состоит верхний слой кожи, волосы, ногти и другие роговые структуры у наземных позвоночных). Мономеры и димеры белков ПФ, в отличие от димеров тубулина и мономеров актина, не связывают трифосфатнуклеотиды. Регуляция сборки и разборки ПФ изучена плохо. Видимо, в некоторых случаях их быстрая разборка происходит за счет фосфорилирования (как и распад ядерной оболочки из ламинов). Ядерные ламины поддерживают форму ядра, обеспечивают целостность ядерной оболочки и прикрепление хромосом
Строение ядерной оболочки.
Ядерная ламина - извилистые зеленые линии. Ядерная ламина прилегает к внутренней поверхности внутренней ядерной мембраны (INM) и помогает поддерживать ядро в стабильном состоянии, участвует в организации хроматина, связывает ядерные поры. В профазе митоза или мейоза у многих организмов белки ядерной ламины фосфорилируются, и это приводит к распаду ядерной оболочки. Также ядерная ламина взаимодействует с белками ядерной оболочки. Число известных белков, взаимодействующих с ламиной, постоянно растёт благодаря новым открытиям. Белки отмечены пурпурным цветом. Среди белков, связывающихся с ядерной ламиной - несприн, эмерин, LAP1, LAP2, рецептор ламина B (LBR) и MAN1. Кламинеприсоединяютсяфакторытранскрипции, такиекак retinoblastoma transcriptional regulator (RB), germ cell-less (GCL), sterol response element binding protein (SREBP1), FOS and MOK2. Barrier to autointegration factor (BAF) - связанный с хроматином белок, который также присоединяется к ламинам и некоторым из вышеупомянутых белков. Белок гетерохроматина-1 (HP1) связывается с хроматином и LBR. Мутации генов, кодирующих ламины, вызывают редкие расстройства, объединяемые в группу ламинопатий. Мутация гена LMNA, кодирующего ламин A, вызывает синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда - исключительно редкое заболевание, вызывающее по неизвестным причинам ускоренное старение: большинство пациентов не доживает до 13 лет.
Состав промежуточных филаментов различается в разных тканях
В эпителиальных тканях ПФ состоят из различных кератинов. В клетках и тканях мезодермального происхождения (например. в фибробластах) ПФ состоят из белка виментина. В мышечных клетках присутствуют ПФ, образованные десмином. В большинстве типов нервных клеток присутствуют белки нейрофиламентов.
Промежуточные филаменты эпителиальных клеток состоят из множества разных кератинов
В геноме человека содержится несколько десятков генов белков-кератинов. В эпителиальных клетках обычно одновременно экспрессируются несколько таких генов.
Промежуточные филаменты эпителиальных клеток обеспечивают механическую прочность эпителиальных пластов
ПФ участвуют в образовании межклеточных контактов эпителиальных клеток - десмосом и гемидесмосом.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПФ - промежуточные филаменты
ЭР - эндоплазматический ретикулум
GFAP - кислый глиальный белок
IFAP - ПФ-ассоциированные белки
ВВЕДЕНИЕ
Помимо основных внутриклеточных компонентов некоторые клетки имеют специализированные структуры, реснички или жгутики, которые позволяют им или самим перемещаться, или перемещать окружающую их жидкость. У многоклеточных животных организмов есть специализированные клетки, мышечная работа которых позволяет производить различные движения органов, отдельных его частей или всего организма. В основе всех этих многочисленных двигательных реакций лежат общие молекулярные механизмы. Кроме того, наличие каких-либо двигательных аппаратов должно сочетаться и структурно связываться с существованием опорных, каркасных или скелетных внутриклеточных образований. Поэтому можно говорить об опорно-двигательной системе клеток.
Существует три системы двигательных элементов, которые различаются по химическому составу, ультраструктуре и функциональным свойствам. Это микрофиламенты, микротрубочки и промежуточные филаменты.
В данной работе будет описана молекулярная организация, ультраструктура и функциональные свойства последней группы двигательных элементов.
ГЛАВА 1. ОБЩЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНОТВ
Промежуточные филаменты (ПФ) нитевидные структуры из особых белков, один из трех основных компонентов цитоскелета клеток эукариот. ПФ строятся из фибриллярных мономеров . Они называются промежуточными, поскольку их диаметр (812 нм) имеет промежуточное значение по сравнению с микротрубочками (25 нм) и актиновыми микрофиламентами (58 нм) . Поэтому основная конструкция ПФ напоминает канат, имеющий толщину около 8-12 нм. Они локализуются главным образом в околоядерной зоне и в пучках фибрилл, отходящих к периферии клеток и располагающихся под плазматической мембраной. Встречаются ПФ во всех типах животных клеток, но особенно они обильны в тех клетках, которые подвержены механическим воздействиям: клетки эпидермиса, нервные отростки, гладкие и исчерченные мышечные клетки. В клетках растений ПФ не обнаружены .
На разных этапах эмбрионального развития, на разных стадиях дифференцировки, в разных типах клеток экспрессируются ПФ, состоящие из разных белков. В некоторых типах клеток одновременно присутствуют несколько различных ПФ. Всего в геноме человека обнаружено около 70 генов, кодирующих различные белки ПФ, которые образуют одно из самых многочисленных белковых семейств .
Исследования in vitro показали очень высокую устойчивость ПФ к механическим нагрузкам. Большое число полипептидов на поперечном сечении филамента, сильные боковые гидрофобные взаимодействия, характерные для белков, содержащих скрученную суперспираль, и электростатические взаимодействия, возникающие при образовании тетрамеров, придают ПФ свойства каната: они легко гнутся, но крайне трудно рвутся. При обработке клетки детергентами, растворами с высокой ионной силой ПФ последними из клеточных структур переходят в раствор, то есть проявляют очень высокую стабильность. ПФ могут собираться in vitro в физиологическом буфере без каких-либо кофакторов после полной денатурации белка в мочевине. Как показали недавние исследования, ПФ проявляют высокую динамичность и подвижность in vivo . Экзогенный виментин, инъецированный в клетку, быстро встраивается в уже сформированные филаменты. Это показывает, что структура ПФ регулируется равновесием между протофиламентами и полимерами и что обмен субъединицами происходит по всей длине филамента.
ГЛАВА 2. БЕЛКИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ
В состав ПФ входит большая группа изобелков. Эти белки, в отличие от глобулярных актина и тубулина, имеют палочковидную форму. Общим свойством всех белков промежуточных филаментов является наличие центрального стержневого домена с высоким содержанием α-спиральных участков. Он очень консервативен по размерам, вторичной структуре и первичной последовательности. Этот стержневой домен имеет около 310 аминокислот (350 для ламинов и белков беспозвоночных) и состоит из 4 α-спиральных участков, соединенных связками. Концевые домены белков ПФ не имеют спиральной структуры. Они сильно различаются по длине и по последовательности аминокислот. Все белки ПФ способны фосфорилироваться. Участки фосфорилирования локализованы на С- и N-концах молекул. Кроме того, белки промежуточных филаментов могут подвергаться другим типам посттрансляционной модификации, а именно, ограниченному протеолизу с помощью высокоспецифичных, активируемых ионами кальция протеаз, гликозилированию, убихитинированию, карбоксиметилированию.
Основываясь на биохимическом, иммунологическом и структурном сходстве, выделяют пять различных типов ПФ.
Наиболее многочисленной и наиболее сложной по составу группой белков ПФ являются кератины, они представлют два типа белков I и II тип. Кислые кератины относятся к типу I (16 изоформ), а основные к типу II (13 изоформ). Для сборки кератиновых ПФ необходимы белки обоих типов они образуют гетерополимеры. Известны эпидермальные кератины, простые эпителиальные кератины и кератины, которые экспрессирутся в волосах, шерсти и ногтях. К белкам ПФ III типа относятся четыре белка: десмин, виментин, переферин и кислый глиальный белок (GFAP). Десмин экспрессируется во всех типах мышечных клеток; виментин обнаружен в фибробластах, лимфоцитах, эндотелиальных клетках и некоторых других мезенхимальных тканях; перферин присутствует, в основном, в периферических нейронах, где он участвует в сборке ПФ вместе с белками IV типа; GFAP экспрессируется в глиальных клетках. В отличие от кератинов белки ПФ III типа могут формировать гомополимеры, однако они могут образовывать и гетерополимеры с другими белками III типа и с белком NF-L. Белки ПФ IV типа экспрессируются, главным образом, в нервных клетках, где они участвуют в радиальном росте аксонов. К ним относится α-интернексин и триплет белков нейрофиламентов: NF-L, NF-M, NF-H. Еще один белок, нестин, впервые обнаруженный в предшественниках нервных клеток, иногда относят к особому типу белков ПФ VI. Однако исходя из его структурных особенностей, нестин можно отнести к IV типу. Кроме вышеперечисленных белков, которые входят в состав цитоплазматических ПФ, существуют еще два типа, сильно от них отличающихся это ядерные ламины, образующие V тип, и два белка VI типа, найденные в хрусталике глаза. Пять типов белков ПФ, выделенных на основе гомологии последовательностей, разделяют на три группы, различающихся принципами сборки. К первой группе относят кератины, ко второй ПФ III и IV типа, а третью группу сборки образуют ламины. Эти три группы могут сосуществовать как 3 независимые системы ПФ внутри одной и той же клетки. Цитоплазматические ПФ могут собираться in vitro в отсутствие вспомогательных белков. Члены первой группы являются облигатными гетерополимерами, то есть для сборки кератиновых филаментов необходимо соединение ПФ I и II типов. Кератины не способны образовывать полимеры с ПФ других типов. Белки ПФ III типа и NF-L, относящиеся ко второй группе сборки, образуют гомополимеры in vitro , однако в клетке они очень часто обнаруживаются в виде сополимеров. Ламины не способны образовывать сополимеры с белками цитоплазматических ПФ .
ГЛАВА 3. СТРУКТУРА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ
Субъединицы промежуточных филаментов включают различные типы мономерных белков, которые состоят только из одного вида белка, тогда как другие (например нейрофиламенты) состоят из трёх различных белков.
Вне зависимости от типа клетки белки ПФ представляют собой волокнистые длинные полипептиды с N -концевым головным доменом, C -концевым хвостовым доменом и центральным стержневым доменом. Последний состоит из α-спирального участка, который содержит серию повторений участка из 7 аминокислот. Этот участок отвечает за образование скрученных спиральных димеров между двумя параллельными α-спиралями.
При формировании ПФ два скрученных спиральных димера связываются друг с другом антипараллельно и образуют тетрамер; т.е. N -конец одного димера и С-конец другого ориентированы в одном направлении. Поскольку N -конец и С-конец белков ПФ различаются, а димеры и тетрамеры уложены антипараллельно, филаменты не полярны; скорее идентичны с каждой стороны. Это отличает их от полярной структуры микротрубочек и актиновых филаментов и объясняет, почему ПФ имеют совершенно другие свойства.
Эластичность этих филаментов обеспечивается в частности тем, что димеры каждого тетрамера расположены в шахматном порядке относительно друг друга; это строение позволяет тетрамерам связываться между собой. Когда тетрамеры выравниваются вдоль оси филамента и связываются со свободными концами, образуется зрелый ПФ .
Анализ первичной последовательности белков ПФ показал, что, несмотря на большое разнообразие, все они имеют общий план строения (рис. 1). У всех белков ПФ есть центральный α-спиральный домен, который фланкирован неспиральными N-концевым («голова») и C-концевым («хвост») доменами. Концевые домены разных типов ПФ сильно различаются по размерам и первичной аминокислотной последовательности.
Рисунок 1. Схематическое изображение молекул некоторых белков ПФ.
Строение центрального домена, наоборот, чрезвычайно консервативно. Он содержит четыре спиральных сегмента 1А, 1В, 2А, 2В, прерывающихся в трех местах короткими не спиральными участками-линкерами L1, L1-2 и L2, которые часто содержат остатки пролина и глицина. Аминокислотная последовательность α-спиральных участков центрального домена состоит из повторов, представляющих собой гептады вида (abcdefg)n, где положения а и d предпочтительно занимают небольшие гидрофобные остатки лейцин, изолейцин, метионин и валин. Такой повторяющийся мотив из 7 а.о. характерен для белков, способных к образованию скрученной α- спирали (coiled-coil) или по-другому суперспирали, состоящей из двух α-спиралей. Поверхность α-спирального домена белков ПФ сильно заряжена. Например, у виментина из 310 аминокислот, образующих центральный домен, заряженными являются 116 70 кислых и 46 основных аминокислот. Таким образом, на одну субъединицу виментина приходится избыток отрицательного заряда 24 кислых аминокислотных остатка. В отличие от центрального домена, «голова» многих белков ПФ заряжена положительно. У виментина в N-концевом домене содержится 12 аргининов, а у ламина B2 3. При этом количество положительно заряженных аминокислотных остатков коррелирует с длиной N-концевого домена (у виментина он состоит из 102 остатков, а у ламина В2 из 25). Даже кислый глиальный белок, с коротким N-концевым доменом из 68 аминокислот, содержит 9 основных остатков. Считают, что положительно заряженные аминокислотные остатки «головы» взаимодействуют с отрицательно заряженными аминокислотами центрального домена. Кроме того, эти заряженные кластеры на поверхности филаментов могут являться потенциальными участками связывания с различными клеточными компонентами.
Центральный домен цитоплазматических ПФ длиной около 45 нм состоит из 310 аминокислот. У ядерных ламинов из-за наличия дополнительных 42 аминокислот в сегменте 1В, центральный домен содержит 356 аминокислотных остатков, и его длина составляет 53 нм. Размеры сегментов, образующих α-спиральный домен ПФ, высоко консервативны: 1А 35 аминокислот, 1В 101 аминокислота, 2А 19 аминокислот и 2В 115 аминокислот. Оказалось, что у различных по аминокислотной последовательности ПФ есть две области, расположенные на концах α-спирального домена, неизменные по своему составу. Одна из них участок из 26 a.о., первые две трети сегмента 1А, 8 из которых абсолютно консервативны; другая участок из 32 остатков на самом конце сегмента 2В, содержащий 13 абсолютно консервативных остатков. С помощью метода поперечных сшивок установлено, что обе эти области участвуют во взаимодействии соседних димеров белков ПФ в зрелых филаментах. Еще одной характерной особенностью строения сегмента 2В является небольшое нарушение гептадной структуры. После 8 полных гептад у всех белков ПФ обнаружена вставка из 4 дополнительных остатков. Это нарушение структуры также важно для сборки ПФ. Линкер L1 сильно варьирует по размеру и последовательности, в то время как последовательность линкера L2 высоко консервативна и состоит из 8 аминокислот у всех пяти типов ПФ. Сильнее всего различаются по длине и аминокислотному составу неспиральные концевые домены белков ПФ «голова» и «хвост». Например, длина «хвоста» у кератина К19 всего 9 остатков, а длина «хвоста» нестина 1491 остатков.
Таким образом, все белки ПФ имеют похожий по структуре и размеру центральный домен, несущий суммарный отрицательный заряд, и сильно варьирующие по длине и аминокислотному составу концевые домены, несущие суммарный положительный заряд .
ГЛАВА 4. СБОРКА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ
ПФ это полимеры, которые обладают уникальной способностью к самосборке без участия дополнительных белков и, в отличие от микротрубочек и актиновых микрофиламентов, без дополнительной энергии в виде молекул АТФ или ГТФ. На основе данных о структуре белков ПФ был предсказан возможный механизм их сборки, который затем был в основном подтвержден электронно-микроскопическими наблюдениями, а также с помощью рентгеноструктурного анализа и ЭПР-спектроскопии.
Сборка ПФ происходит в несколько этапов (рис.2). Сначала образуются димеры центральные домены двух полипептидных цепочек обвиваются друг относительно друга, образуя скрученную спираль с шагом 14 нм. Димеры получаются в результате гидрофобных взаимодействий между аминокислотными остатками, расположенными в положениях а и d гептадных повторов взаимодействующих белковых молекул.
Рисунок 2 . Схема, показывающая отдельные этапы самосборки ПФ.
Особую роль в сборке ПФ играют концевые участки центрального домена. Исследования формирования филаментов in vitro показали, что даже точечная замена аминокислоты на N-конце сегмента 1А или на С-конце сегмента 2В приводит к серьезным нарушениям их структуры.
Следующий этап сборки соединение димеров в более крупные комплексы. В случае цитоплазматических ПФ это объединение димеров в тетрамеры, что отличает их от ламинов, которые при сборке соединяются по механизму «голова к хвосту» образуя линейные полимеры. В образовании тетрамеров участвуют электростатические взаимодействия чередующихся зон положительных зарядов, избыток которых имеется в N-концевом домене виментина, и отрицательных, преобладающих в центральном домене молекулы. Существует несколько моделей соединения димеров в тетрамеры, предложенных на основе результатов, полученных методом поперечных сшивок (рис. 3).
Рисунок 3. Схема, показывающая три возможных модели образования тетрамеров при сборке ПФ.
Этот метод заключается в образовании ковалентной связи между определенными остатками аминокислот соседних молекул с помощью специальных реагентов, имеющих две реакционных группы, взаимодействующие с этими остатками. Чаще других используются реагенты, которые реагируют с лизином или цистеином. Полученные комплексы выделяют, очищают, расщепляют протеазами и анализируют при помощи хроматографии. Сравнение хроматографических профилей образцов, полученных до и после расщепления сшивок периодатом натрия, позволяет обнаружить несколько возможных вариантов поперечных сшивок между молекулами или внутри одной молекулы. Пики на хроматограммах, которые исчезают после обработки периодатом натрия, соответствуют молекулам, которые образовались в результате поперечных сшивок между разными молекулами или внутри одной молекулы белка. Таким образом, этот метод позволяет обнаружить участки белков, расположенные в непосредственной близости друг от друга, т.е. выяснить взаимное расположение субъединиц в филаментах. Большинство пептидов, полученных в результате протеолитического расщепления виментиновых ПФ, оказались довольно короткими (меньше 10 остатков), так что их аминокислотный состав позволил однозначно определить расположение пептида внутри последовательности виментина. В некоторых случаях, когда обнаруживался только один пептид после обработки периодатом, это означало, что поперечная сшивка образовалась внутри цепи.
Для виментина были найдены 16 уникальных поперечных сшивок, 5 из которых возникают между двумя параллельными цепочками, находящимися «в регистре» и образующими двухцепочечную скрученную гомодимерную молекулу виментина. 11 поперечных сшивок могут быть отнесены к трем возможным моделям межмолекулярного взаимодействия, изображенным на рис. 3. Модель А 11 (6 поперечных сшивок) предполагает, что два антипараллельных димера взаимодействуют таким образом, что 1В сегменты их центральных доменов значительно перекрываются. Согласно другой модели, А 22 (3 поперечные сшивки), два антипараллельных димера перекрываются в области сегментов 2В. В третьей модели А 12 (2 поперечных сшивки) два димера антипараллельны и полностью перекрываются. Существование этих трех типов взаимодействия димерных молекул было подтверждено для кератинов. Для виментина предложена еще и четвертая модель взаимодействия между димерными комплексами в составе филаментов A CN . Если два тетрамера, образованные согласно моделям А 11 и А 22 , оказываются рядом, то по одному димеру из каждого тетрамера будут взаимодействовать по принципу «голова-хвост». В этом случае 510 N-концевых остатков сегмента 1А одного димера будут перекрываться с 510 C-концевыми остатками сегмента 2В другого димера. Сходные данные были получены и для структуры десминовых ПФ.
До недавнего времени структурную информацию о сборке ПФ можно было получить, только наблюдая препараты, зафиксированные через определенные промежутки времени, при помощи электронного микроскопа. Позднее для наблюдения за ходом процесса сборки был применен метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (small angle x-ray scattering SAXS), который используется для исследования макромолекул в растворе. Оказалось, что сборка виментиновых ПФ in vitro происходит с последовательным образованием различных олигомеров, включающих тетрамеры, октамеры единичный протофиламент, состоящий из четырех октамеров. Измерения, проведенные с помощью этого метода, указывают на то, что димеры в тетрамере находятся на расстоянии 3,4 нм друг от друга, в то время как расстояние между скрученными спиралями 1,5 нм. Возможно, такое разъединение связано с тем, что непосредственный контакт кислых центральных доменов электростатически неблагоприятен. Также оказалось, что соединение димеров в тетрамер в соответствии с моделью А 11 происходит во многом благодаря второй половине головного домена (3570 остатков), т.е. электростатическое притяжение положительно заря женной «головы» и кислого центрального домена, по-видимому, является движущей силой. Конечная субъединица ПФ - протофиламент единичной длины (65 нм) в среднем состоит из четырех октамеров. В поперечном сечении протофиламент единичной длины скорее овальный, чем круглый. Согласн измерениям, полученным с помощью сканирующего электронного микроскопа, отдельные протофиламенты могут значительно различаться по количеству образующих его виментиновых цепочек. На последнем этапе сборки происходит уплотнение субъединиц филаментов до толщины 1012 нм. Возможно, этот этап также сопровождается перестройкой внутри филаментов, потому что варианты сборки тетрамеров А 22 и А 12 обнаруживаются только в зрелых структурах. Существование тетрамеров виментина in vivo уже доказано, а вот вопрос о присутствии других промежуточных компонентов сборки, таких как октамеры или единичные филаменты, требует дальнейших исследований. Количество протофибрилл (октамеров), приходящихся на поперечный срез ПФ, варьирует от 2 до 6, в зависимости от типа ПФ и условий сборки. Предполагается, что каждая протофибрилла состоит из двух протофиламентов, а каждый протофиламент, в свою очередь, состоит из тетрамеров, соединенных конец к концу. Таким образом, по ширине один филамент может состоять из 2440 полипептидов (обычно из 2 8 тетрамеров). Толщина может меняться не только от одного филамента к другому, но даже в пределах одного филамента .
Иначе полимеризуются белки ядерной ламины: они образуют димеры с головками на одном конце и полимеризуются, создавая рыхлую прямоугольную решётку.
Топографически в клетке расположение ПФ повторяет расположение микротрубочек, они как бы идут бок о бок. При разрушении микротрубочек колхицином происходит так называемый коллапс ПФ: они собираются в плотные пучки или кольца вокруг ядра. Восстановление новой сети ПФ начинается от зоны клеточного центра. Это наводит на мысль о том, что центром их полимеризации или нуклеации могут быть центры, общие с микротрубочками .
ГЛАВА 5. ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ В КЛЕТКЕ
Зрелые ПФ и их предшественники динамичны и подвижны внутри клеток. Сборка, разборка и перемещение ПФ в клетках происходят непрерывно. Образование внутриклеточной сети раз личных типов ПФ в разных типах клеток происходит по-разному. Это может быть связано с тем, что ПФ взаимодействуют с разными типами молекулярных моторов и другими факторами. Субъединицы ПФ и зрелые полимеры находятся в цитоплазме в равновесии, и включение новой субъединицы может происходить в любом месте зрелого филамента. Однако образование сети ПФ начинается около ядра. Перемещаются в клетках не только отдельные субъединицы, но и зрелые фибриллы. Для виментиновых ПФ было показано, что они могут перемещаться в цитоплазме как по направлению к клеточной поверхности, так и по направлению к ядру. Средняя скорость перемещения длинных ПФ составляет 0,20,3 мкм/мин, субъединицы ПФ двигаются быстрее (12 мкм/сек), в основном вдоль микротрубочек. Большинство из них (6570%) перемещается к периферии клетки. Способность виментиновых субъединиц двигаться вдоль микротрубочек в разном направлении объясняется их ассоциацией с моторными белками кинезином и динеином. Связывание с кинезином обуславливает движение виментиновых филаментов и их субъединиц к плюс-концу микротрубочек и к поверхности клетки. Движение к минус-концу микротрубочек, к ядру, обусловлено взаимодействием с моторным комплексом, состоящим из динеина и динактина. По-видимому, эти взаимодействия необходимы для формирования и поддержания сети ПФ. Длинные виментиновые ПФ связываются с IFAP, например, с плектином, который образует поперечные связи между отдельными ПФ и другими структурами цитоскелета, тем самым препятствуя их движению. По-видимому, такое взаимодействие необходимо для стабилизации ПФ в особых областях цитоплазмы, подвергающихся механическому стрессу или деформации. В отличие от виментиновых ПФ, состоящих из одного белка, кератиновые ПФ всегда являются гетерополимерами. Поэтому для поддержания стабильной сети кератиновых филаментов необходим баланс между кератинами I и II типа, избыток кератинов одного из типов приводит к нарушению сети ПФ. Интересно, что в клетках, одновременно экспрессирующих кератин и виментин, длинные кератиновые филаменты двигаются в 3 раза медленнее виментиновых (0,06 мкм/мин), а кератиновые субъединицы в 15 раз медленнее виментиновых субъединиц. Кроме того, транспорт кератиновых субъединиц в основном направлен к ядру (84%). Возможно, причина этих различий заключается в разной способности кератинов и виментина связываться с микротрубочками и моторными белками. Действительно, большая часть кератиновых субъединиц ассоциирована с сетью актиновых микрофиламентов, и динамические свойства кератиновых ПФ обусловлены взаимодействием с миозином. А поскольку миозин перемещается медленнее моторных белков, ассоциированных с микротрубочками, этим, возможно, и объясняются различия в скорости перемещения кератинов и виментина внутри одного типа клеток. Особый интерес представляет формирование системы ПФ в нейронах, называемых нейрофиламентами. Отростки этих клеток могут достигать длины порядка метра. Если бы транс порт ПФ происходил с той же скоростью, что и медленный транспорт других структур цитоскелета (0,38 мм/день), то понадобились бы годы, чтобы они могли достичь дистальных областей отростков. Однако субъединицы нейрофиламентов перемещаются вдоль аксона со скоростью, равной 1,8 мкм/сек, так как они транспортируются по микротрубочкам при помощи кинезина и динеина. Правда, движение этих структур прерывается долгими паузами, так что двигаются они только 27% времени, а в зрелых сенсорных аксонах нейрофиламенты находятся в покое около 99% времени .
ГЛАВА 6. ФУНКЦИИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ФИЛАМЕНТОВ
По сложившимся представлениям, основной функцией ПФ является поддержание клеточной и тканевой целостности, основанной на их механических свойствах и способности к самосборке. Повышенный интерес к их механической роли связан с тем, что известны наследственные заболевания, вызванные нарушениями структуры ПФ в тканях, подверженных механическому стрессу, таких как кожа, мышцы и кровеносные сосуды. Однако ПФ имеются во всех типах клеток, в том числе и не подверженных механическому стрессу, а нарушение их сетей также приводит к патологическим последствиям. Существуют, например, серьезные болезни, связанные с нарушением функций ПФ в нервной системе. Этот факт, а также динамическая природа ПФ и наличие большого количества связанных с ними сигнальных белков, указывает на то, что ПФ не только обеспечивают устойчивость к внешним воздействиям, но также выполняют другие специализированные функции в клетках. Хотя эти функции в различных типах клеток пока недостаточно изучены, уже сейчас видно, как велико их значение. По-видимому, немеханическая функция ПФ связана с их участием во внутриклеточном распределении органелл и белков, а также в транспорте липидов. Функции ПФ обусловлены их взаимодействием с многообразными клеточными компонентами. Так, механическую целостность клеток ПФ обеспечивают, связываясь с другими компонентами цитоскелета микротрубочками, микрофиламентами и плазматической мембраной, взаимодействие с которой происходит в особых участках прикрепления: в десмосомах и полудесмосомах эпителиальных клеток и в местах фокальных контактов фибробластов. Для взаимодействия с такими органеллами, как митохондрии, аппарат Гольджи, эндосомы и лизосомы ПФ связываются с различными компонентами мембран этих органелл. Это связывание обеспечивается большим семейством белков IFAP, но, по-видимому, может происходить и непосредственно.
6.1. Механические функции
Как показывают электронно-микроскопические исследования, различные структуры цитоскелета связаны между собой и с мембранными органеллами. Различимые на электронных микрофотографиях «мостики» долгое время считались связующими структурами неизвестной природы. Позже выяснилось, что за связь многих клеточных органелл с микротрубочками отвечают молекулярные моторы кинезины и динеины. Роль кинезина для взаимодействия ПФ с микротрубочками была продемонстрирована с помощью антител, блокирующих работу этого моторного белка. Оказалось, что радиальное распределение ПФ вдоль микротрубочек осуществляется благодаря кинезин-зависимому транспорту.
Но основную роль во взаимодействии ПФ со многими клеточными компонентами играют IFAP, которые соединяют их и с органеллами, микрофиламентами и микротрубочками, и с межклеточными контактами. Такие белки, как десмоплакин, BPAG1 и плектин относятся к семейству плакинов. Все они содержат очень длинный центральный α-спиральный домен, который обра зует скрученную спираль при образовании димерного комплекса. Центральный домен фланкирован не спиральным N-концевым доменом, который может содержать места связывания с актином и/или места связывания с микротрубочками, и С-концевым доменом, который, помимо участков связывания с ПФ, может содержать различное количество повторяющихся доменов А, В, С, типичных для десмоплакина.
Наиболее хорошо изучен белок плектин, который может соединять три различные цитоскелетные системы и взаимодействовать с различными белками. При помощи электронной микроскопии можно увидеть, что плектин образует боковые отростки, отходящие от ПФ, длиной примерно 200 нм и толщиной 23 нм. Способность плектина связываться с ПФ обоими концами навела на мысль, что концы его цепи одинаковы по своим свойствам, и его молекулы являются гомотетрамерами. Количественный анализ комплексов виментин-плектин показал, что на участок ПФ длиной 1мкм приходится 10 молекул плектина. В мышцах плектин колокализуется с десминовыми ПФ около Z-дисков и структур, образующих внутриклеточный миофибриллярный каркас.
6.2. Внутриклеточное распределение органелл
Вплоть до недавнего времени никто не предполагал, что ПФ могут участвовать в мембранном транспорте, однако недавно было показано, что ПФ играют важную роль не только в транспорте мембранных органелл, но и в их функционировании.
6.2.1. Митохондрии и промежуточные филаменты
Одним из наиболее важных для физиологии клеток типом мембранных органелл являются митохондрии. Они располагаются около ПФ в различных типах клеток, и это, по-видимому, играет важную роль. Так оказалось, что у митохондрий в сердечных и скелетных мышцах, лишенных десмина, изменяется морфология и внутри клеточная локализация. Кроме того, в таких митохондриях наблюдается прогрессирующее разрушение матрикса, а сами они собираются в группы около сарколеммы. Все эти изменения приводят к нарушению функций митохондрий: снижается максимальная скорость дыхания, АДФ-стимулируемое потребление кислорода, исчезает креатинкиназа, падает уровень цитохрома с.
6.2.2. Аппарат Гольджи и промежуточные филаменты
Аппарат Гольджи располагается вдоль ПФ около центра организации микротрубочек. Взаимодействие аппарата Гольджи и виментиновых ПФ хорошо изучено, и найдены белки, с помощью которых происходит их связывание. Один из них форм-имино-трансфераза циклодеаминаза, белок, расщепляющий гистидин. Другой белок аппарата Гольджи - GM130 при разрушении микротрубочек, приводящем к нарушению распределения аппарата Гольджи, также локализуется вдоль виментиновых филаментов. Третий белок, MICAL (molecule interacting with CasL), непосредственно связывает виментин и ГТФазу Rab1, которая является главным участником везикулярного транспорта от эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи. Таким образом, связь между ПФ и аппаратом Гольджи, изученная на культуре клеток, играет, по-видимому, важную физиологическую роль.
6.2.3. Эндосомы, лизосомы и промежуточные филаменты
Другим примером участия ПФ в функциях мембранных органелл является их роль в транспорте эндосом и лизосом. Установлено, что виментин, периферин и α-интернексин связываются с адаптерным белком АР-3. Белок АР-3 это гетеротетрамерный адаптерный комплекс, который участвует в транспорте везикул между эндосомальным и лизосомальным компартментами и регулируетпоступление белков в лизосомы и тканеспецифичные органеллы меланосомы, гематопоэтические гранулы и синаптические везикулы. С ПФ белок АР-3 взаимодействует при помощи специализированного домена субъединиц β3А и β3В, который также необходим для выполнения АР-3 функции, связанной с сортировкой белков, и это единственный его участок, взаимодействующий с виментином. Отсутствие в клетках АР-3 или виментина приводит к появлению одинакового фенотипа, в обоих случаях нарушается распределение ионов цинка. В фибробластах, лишенных АР-3 или виментина, снижается его уровень. Внутриклеточный цинк в основном локализуется в эндоцитарных везикулах и в эндосомах, а его запасание зависит от тока ионов хлора через их мембраны. Каналы, через которые поступает хлор, регулируют и рН в эндосомах, и запасание в них ионов цинка. Белки, образующие эти каналы, переносятся мембранными везикулами, с которыми связан адаптерный комплекс АР-3. Предполагается, что отсутствие комплекса АР-3 в клетках приводит к нарушению рН внутри эндосом, который определяется транспортом ионов хлора. У клеток, лишенных виментина, содержание цинка в везикулах падает в 40 раз.
Другой груз, за транспорт которого отвечает комплекс АР-3, это молекула LAMP-2 (lysosome associated membrane protein). Она представляет собой резидентый белок эндосом и лизосом, который нужен для их слияния с вакуолями автофагосом, которые образуются из эндоплазматического ретикулума, охватывают органеллу, предназначенную для расщепления, и доставляют ее к лизосомам или эндосомам. Показано, что нарушение сборки ПФ приводит к нарушению образования вакуолей автофагосом, однако механизм их взаимодействия пока не известен. Существует предположение, что совместное действие ПФ и АР-3 связано с транспортом белка LAMP-2. Важно отметить, тем не менее, что локализация эндосом и лизосом от ПФ не зависит.
6.2.4. Ядро и промежуточные филаменты
Одной из важных функций ПФ является локализация ядер. Однако роль ПФ в локализации ядра изучена пока недостаточно. Скорее всего, она заключается в удержании ядра на месте и в привлечении белков, которые могли бы взаимодействовать с остальными компонентами цитоскелета.
6.2.5. Другие функции промежуточных филаментов
К другим известным функциям ПФ можно отнести их участие в под держании липидного состава мембран. Так, в преадипоцитах отсутствие или нарушение структуры виментиновых ПФ вызывало снижение стабильности триглицеридов, а в фибробластах и клетках надпочечников приводило к нарушению метаболизма холестерина. Целый ряд данных указывает на то, что изменения в липидном составе мембран возникают в результате повреждений, происходящих на поздних стадиях эндосомального пути. Оказалось, что с виментиновыми ПФ взаимодействует один из ключевых ферментов холестеринового обмена оксистеролсвязывающий белок. В клетках, лишенных ПФ, наблюдается повышение синтеза холестерина, и снижение образования из него сложного эфира. Предполагают, что это также связано с нарушениями перехода холестерина в эндосомальные и лизосомальные мембраны. Также замедляется созревание гликосфинголипидов в клетках, лишенных ПФ, потому что затруднен их транспорт из аппарата Гольджи в эндосомальную систему. Нарушения транспорта липидов говорят о том, что, по-видимому, роль взаимодействия транспортных везикул с ПФ чрезвычайно важна. В заключение можно отметить многообразие функций ПФ в клетке. Наряду с другими компонентами цитоскелета они обеспечивают механическую прочность клетки, участвуют в правильном расположении внутриклеточных органелл и ядра и в транспорте белков. Однако некоторые детали и тонкие механизмы этих взаимодействий пока остаются невыясненными, как и роли многих участников .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Необходимость более глубокого изучения принципов и механизмов функционирования ПФ в различных типах клеток диктуется, прежде всего тем, что нарушения, связанные с этими структурами цитоскелета являются причиной многих патологических состояний. К настоящему времени установлены мутации генов белков ПФ, лежащих в основе тяжелых наследственных заболеваний. Среди них есть такие, как наследственный буллезный эпидермолиз, связанный с мутациями кератинов 5 и 14; миопатия и кардиомиопатия, вызванные нарушениями десмина; такие тяжелые неврологические заболевания, как амиотрофический латеральный склероз и болезнь Александра, связанные с мутациями периферина и GFAP, соответственно; болезнь Паркинсона и некоторые другие тяжелые нервные патологии, причиной которых являются нарушения нейрофиламентов. Другим приложением фундаментальных знаний о ПФ явилось успешное использование образующих их белков в качестве маркеров различных злокачественных опухолей. Для многих видов опухолей тип «неправильного» белка ПФ может служить диагностическим маркером. В последнее время в связи с повышенным интересом к проблеме использования стволовых клеток многие исследователи обратили внимание на ПФ как удобный маркер клеточной дифференцировки. Действительно, выяснив, какой белок ПФ экспрессируется в клетках, можно легко и быстро определить их тип. Таким образом, ПФ представляют собой важный компонент цитоскелета, который обладает многими уникальными свойствами и играет важную роль в физиологии клеток.
ЛИТЕРАТУРА
- Wiki - Linki [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://wiki-linki.ru/Page/1580780 .
- Виментиновые промежуточные филаменты и их роль во внутриклеточном распределении органелл / А.А. Минин, М.В. Молдавер // Успехи биологической химии. 2008. Т. 48, С. 221-252.
- Введение в клеточную биологии. Учебник для вузов. 4-е изд., перераб. и доп. / Ю.С. Ченцов. М.: ИКЦ «Академкнига», - 2004. 495 с.
- Фалер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. Пер. с англ. М.: Издательство БИНОМ, 2006. 256 с.
Цитоскелет
Понятие о цитоскелете было введено Н.К. Кольцовым-русским цитологом в начале 20-го века. Но про это забыли,и в 1950 с помощью электронного микроскопа(метод иммунофлюорисценции) цитоскелет был переоткрыт.
3 типа филаментов различающихся по структуре, химическому составу и функциональным свойствам:
· Микрофиламенты (6 нм белок актин)Преобл.В мышечных клетках
· Микротрубочки (25нм белок тубулин)Преобл.Пигментные клетки
· Промежуточные филаменты (14 нм разные,но родственные белки)Преобл.В клетках эпидермиса.
Общие функции:
· Каркас клетки
· Физиологическое предвижение клеточного компонента/самой клетки
Общее в строении:
· Встречаются у всех без исключения эукариотических клетках
· Белковые неветвящиеся фибрилярные полимеры
· Нестабильные (может приводить к некоторым вариантам клеточной подвижности)
· Способны к полиримезации/деполиримезации
По свойствам и функциям:
· Каркасные (Промежуточные филаменты)
· Опорно-двигательные (микрофиламенты (взаимодействуют с моторными белками- миозинами);Микротрубочки (взаимодействуют с моторными белками динеинами и кинезинами )
2 типа передвижения:
1. На основе свойства белков актина и тубулина полимеризоваться/деполимеризоваться.(Связываются с мембраной клетки,изменяя её морфологические изменения в виде выростов(псевдоподий/ламллоподий)
2. Актин или тубулин являются направляющими структурами,по которым предвигаются специальные моторные белки-мотры,связвающиеся с мембранными\фибрилярными компонентами,участвуя в передвижении.
Промежуточные филаменты
Канат 10-14 нм
Локализация: Околоядерные зоны, в пучках фибрилл(отходят к переферической зоне, расолагаются под плазматичской мембраной).
Встречаются во всех эукариотических клетках, в особенности, в клетках наиболее подвергающихся механическому воздействию.(Клетки эпидермиса, нервные отростки, исчерченные мышечные клетки).
В клетках растений не обнаружено
Состав: Большая группа сходных белков(изобелков ):
· Кератины:
1. Встречаются в эпитальных клетках
2. Образуют гетерополимеры
3. Гетерогенны
4. M=40-70тыс.
· Виментин (клетки мезенхимной ткани)
Десмин (Клетки мышечного происхождения)
Периферин (Переферические и центральные нейроны)
M=40-50 тыс.
· Белки нейрофиламентов (аксоны нервных клеток M=60-130тыс.)
· Белки ядерной ламины.
1. Ядерная локализация
2. Сходны по строению и свойствам со всеми белками промежуточных микрофиламентов
Некоторые белки могут образовывать сополимеры (виментин с десмином)
1 - отдельная молекула; 2 - димер; 3 - тетрамер-протофиламент; 4, 5 - полимеризация протофиламентов; 6 - сформированный промежуточный филамент
Самые долговечные.
Повторяют расположение микротрубочек
Белки промежуточных филаментов в разных тканях одного организма различны более,чем белки промежуточных филаментов одной ткани разных организмов.
