Фазы апоптоза кратко. Апоптоз
Апоптозом называется запрограммированная клеточная гибель. Этот процесс играет важную роль в росте и развитии организма, т. к. по мере созревания тканей некоторые клетки должны погибнуть, чтобы уступить место более дифференцированным и специализированным.
Если клетка не умирает и становится бессмертной, может развиться злокачественная опухоль . Впервые апоптоз был описан в 1970-е годы, но только в последнее время исследователи осознали его важную роль для развития организма, дифференцировки тканей и малигнизации.
Интерес к апоптозу
возрос, когда выяснилось, что этот процесс находится под контролем генов, вовлеченных в злокачественную трансформацию, т. е. онкогенов, протоонкогенов и генов-супрессоров. Очевидно, что многие из этих генов активны во время развития организма.
Полагают, что изучение апоптоза
и путей его регуляции позволит понять механизмы развития организма и старения. Утрата клеточного контроля над программированной клеточной гибелью ведет к развитию опухолей.
Апоптоз - особый вид клеточной гибели, ответственный за устранение клеток в нормальных тканях. Тем не менее этот процесс наблюдается и при патологических процессах. Гистологически проявляется уменьшением клетки, буллезным разрушением клеточной мембраны и конденсацией клеточного ядра.
В итоге образуются апоптотические тельца , содержащие неповрежденные органеллы; окружающие клетки фагоцитируют эти тельца. Апоптоз не сопровождается воспалением, что отличает его от некроза. Последний сопровождается набуханием клетки, разрушением всех ее структур и развитием воспалительного ответа.
На молекулярном уровне при апоптозе происходит саморазрушение генома на мельчайшие фрагменты, осуществляемое ферментами самой клетки; в итоге при электрофорезе образующихся клеточных компонентов в полиакриламидном геле выявляется характерная «лестница» из фрагментов ДНК.
Апоптоз играет важную роль в нормальном росте организма, а также в развитии и прогрессировании злокачественных опухолей. Спонтанный апоптоз встречается в злокачественных клетках и даже замедляет их рост.
Интенсивность этого процесса возрастает при облучении опухоли , проведении гормоно- и химиотерапии, при нагревании опухоли. В злокачественных опухолях апоптоз представляет механизм уничтожения клеток, в которых произошли канцерогенные изменения ДНК.
Однако если он заблокирован или подавлен мутациями контролирующих его генов, например BCL2 или ТР53, то эти клетки получают возможность свободно делиться и неограниченно накапливать мутации. Такая генетическая нестабильность - ранний этап развития злокачественных опухолей.
Многие из современных методов лечения, например лучевая и химиотерапия , направлены на уничтожение клеток за счет повреждения их ДНК. Мутации гена BCL2 или ТР53 ухудшают эффективность лечения, т. к. подавляют клеточную гибель.
Более глубокое понимание процессов запрограммированной клеточной гибели может привести к разработке новых, более эффективных методов лечения. Ингибиторы апоптоза (например, протоонкоген BCL2) могут быть ответственны за развитие резистентности к противоопухолевым препаратам, позволяя выживать клеткам с патологической ДНК.
Вероятно, в дальнейшем будут выявлены и другие механизмы подавления . Не следует думать, что этот процесс отражает нечто иллюзорное в биологической литературе, а термин принят только для описания отличной от некроза клеточной гибели. Апоптоз - фундаментальный процесс, контролируемый на молекулярном уровне, и можно надеяться, что его удастся расшифровать и использовать для медицинских нужд. Возможные механизмы апоптоза представлены на рисунке.
Возможные механизмы апоптоза и факторы, его контролирующие.
Внеклеточный сигнал запускает каскад событий, вовлекающий молекулы BCL2, BCL-xL и ВАХ.
Это ведет к наступлению программированной гибели клетки.
Этот механизм может быть заблокирован на любом из множества этапов, в результате чего клетка становится бессмертной.
ICE - интерлейкин-1b-превращающий фермент.
УДК 61 1.018.1:611.013.1 1:618.32-091.8
АПОПТОЗ: ПОНЯТИЕ, МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ, ЗНАЧЕНИЕ*
© 2006 г. О. Ю. Варга, В. А. Рябков
Государственный университет, г. Петрозаводск
В статье дано понятие апоптоза, программированной клеточной гибели, изложены современные представления о механизмах реализации - пути «рецепторов смерти», характерном для физиологических процессов, и митохондриальном пути активации апоптоза, характерном для патологических процессов, основных участниках, роли эндоплазматичес-кого ретикулума, значении апоптоза для биологии и медицины.
Ключевые слова: апоптоз, программированная клеточная гибель, цитокины, каспазы, путь «рецепторов смерти», митохондриальный путь.
Апоптоз (А) представляет собой особую, генетически запрограммированную, форму гибели клетки и является необходимым условием нормального существования организма. Назначение А состоит в поддержании постоянства численности клеток, обеспечении правильного соотношения клеток различных типов и удалении генетически дефектных клеток. Клетки, подвергающиеся такой программированной смерти, активно используют генетически контролируемую программу, нацеленную на собственную гибель, совершая тем самым своего рода суицид. Гибель клеток происходит в пользу сообщества, следовательно, можно говорить о социальном поведении клетки. Без сомнения, А - способ очистки клеточной популяции от ненужных или нежелательных клеток.
Со времени введения термина «апоптоз» J. Kerr в 1972 году интерес к процессу физиологической гибели клеток неуклонно растет, что связано с выявляемыми его нарушениями в ряде патологических состояний, в том числе при аутоиммунных и онкологических заболеваниях .
Процесс А характеризуется определенными особенностями морфологии - ядро и цитоплазма уменьшаются в размерах, конденсируются, фрагментируются, клетка распадается на несколько частей (апоптотические тельца), содержащих элементы ядра и интактные органеллы . Ядро подвергается разрушению через образование крупных фрагментов с последующей их межнуклеосомной деградацией. Плазматическая мембрана клетки претерпевает ряд изменений, делающих ее узнаваемой для фагоцитов, в результате чего апоптотические тельца быстро поглощаются макрофагами, а также нередко и окружающими клетками, не специализирующимися в фагоцитозе .
Таким образом, структурная целостность биологических мембран в ходе А не нарушается, что предупреждает выход содержимого цитоплазмы (в том числе лизосомальных ферментов) во внеклеточную среду и развитие воспаления . Поэтому процесс А, как правило, происходит без макроскопических признаков, структурных и функциональных дефектов ткани и без развития воспаления .
В отличие от А некроз характеризуется увеличением проницаемости мембран вследствие нарушения их структуры, повреждением органелл, разрывом плазматической мембраны и финальным клеточным лизисом с выходом цитозоля в экстрацеллюлярное пространство и развитием воспалительного процесса .
* Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации № МК-1814.2004.7.
Механизмы апоптоза
Условно весь процесс А может быть разделен на две фазы: формирование и проведение апоптотических сигналов и демонтаж клеточных структур .
Пути, которыми достигается конечная цель А - гибель клетки, различны и включают сложное взаимодействие большой группы веществ, центральное место среди которых занимают особые протеа-зы - каспазы (caspases, Cytosolic Aspartate-Specific cysteine Proteases). Каспазы (К) представляют собой аспартат-специфические протеазы, расщепляющие белки в местах расположения аспарагиновых оснований . Эти соединения расположены в цитоплазме в неактивном состоянии для исключения возможности случайной гибели клетки .
Каспазы состоят из трех доменов: N-концевого домена; большой субъединицы; малой субъединицы. Активация К происходит путем протеолитического отщепления N-концевого домена с ассоциированием субъединиц в гетеродимер и формированием активного центра .
По своим функциональным обязанностям и структурной гомологии К подразделяются на три группы: активаторы цитокинов (К 1, 4, 5, 13); индукторы активации эффекторных К (К 2, 8, 9, 10); эффекторные К - исполнители А (К 3, 6, 7) .
Основные направления разрушительного действия К на клетку:
1. Инактивация ингибиторов апоптотических белков: CAD (каспазактивированная ДНК-аза) соединена с белком-ингибитором IСАD; активированные К 3 и 7 разрушают белок ICAD, запуская действие ДНК-азы .
2. Прямое расщепление структурных белков клетки: ядерный ламин - белок, жестко связанный с ядерной мембраной и организующий структуру хроматина; активированная К 6 расщепляет ламин, приводя к конденсации хроматина .
3. Нарушение регуляции белкового синтеза: гелсо-лин регулирует натяжение нитей актина; эффекторные К расщепляют гелсолин, нарушая цитоскелет .
4. Инактивация белков, вовлеченных в репарацию ДНК, образование мРНК, репликацию ДНК .
Принято выделять два принципиально различных механизма активации К: путь «рецепторов смерти», расположенных на поверхности клетки, характерен для неповрежденных клеток; митохондриальный путь, опосредованный семейством белков Bcl-2, характерен для патологически измененных клеток .
Механизм регуляции с помощью цитокинов
(путь «рецепторов смерти»)
Цитокины - группа белков, которые посредством связывания со специфическими рецепторами на клетках-мишенях регулируют их пролиферацию и дифференцировку. Процесс А запускается в момент взаимодействия специфического рецептора и его лиганда - экстрацеллюлярного белка смерти (TNF-a, FasL, TRAIL, Apo-3L) . Наиболее изученным из
индукторов клеточной гибели является Fas-лиганд (FasL) - цитокин семейства фактора некроза опухолей с молекулярной массой 37кД, вызывающий при взаимодействии со специфическим рецептором Fas^PO/CD95 А клетки. FasL экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и НК-клетках. В тес-тикулах и тканях глаза FasL обеспечивает защиту от иммунного повреждения собственных клеток .
Fas представляет собой гликозилированный поверхностный белок мембраны клеток с молекулярной массой 48кД, который экспрессируется на поверхности активированных Т- и В-лимфоцитов, клетках различных опухолей, некоторых нормальных клетках человека . Fas также встречается в растворимой форме (sFas), которая лишена трансмембранного участка.
При связывании FasL с тремя молекулами Fas привлекается FADD (Fas associated death domain, связанный с Fas «регион клеточной смерти»), который одним концом связан с DD (death domain, «регион смерти»), относящимся непосредственно к рецептору, а другим (N-терминальный регион, DED (death effector domain, «регион исполнителя смерти»)) взаимодействует с прокаспазой (проК 8 или проК 10), вызывая ее аутокаталитическую активацию . Таким образом формируется DISC (индуцирующий смерть сигнальный комплекс) , включающий в себя DD, FADD, DED, проК 8.
Итогом формирования DISC является активация специфической протеазы - К 8 (FLICE), обеспечивающей процесс А. Активная К 8 запускает А двумя путями:
Каспаза 8 активирует проК 3 (при достаточном количестве К 8 в DISC): К 3 способна к аутокатализу; К 3 активирует другие эффекторные К; К 3 активирует фактор фрагментации ДНК
Специфическую ДНКазу (CAD/DFF40).
Каспаза 8 расщепляет белок Bid семейства Bcl-2 (как обходной путь, необходимый при низком уровне К 8 в DISC): выделяется митохондриальный цитохром С (специфический инициирующий фактор); цитохром С взаимодействует с APAF-1 (apoptotic protease activating factor - апоптотический протеаза-активирующий фактор) и проК 9 через CARDs (caspase recruitment domains); формируется комплекс - апоптосома; апоптосома приводит к активации К 9; через К 9 происходит активация эффекторных К 3, 6, 7 .
Как уже упоминалось, помимо системы Fas/FasL существуют другие, влияющие на А. В настоящее время известно еще 4 специфических рецептора к белкам смерти (рецепторы смерти): TNFR1; DR3 (TRAMP, Apo-3, Wsl-1); DR-4 (TRAIL-R1); DR5 (TRAIL-R2) . Соответствующими лигандами будут являться TNF-a, Apo-3L, TRAIL, при этом DR3 является TNFR-ассоциированным доменом белка TRADD, тогда как Fas и DR4 взаимодействуют с Fas-ассоциированным доменом белка FADD .
Следует отметить, что пути активации А, включаемые адаптером TRADD через проК 8, конкурируют с параллельными путями подавления клеточной гибели, что может объяснять данные о различном влиянии TNF-a на А . В частности, подавление А, опосредованное рецептором TNF-R1, идет следующим образом: TNF-R1 через DD домен белка TRADD (TNF receptor-1-associated death domain) и белка, взаимодействующего с рецептором (RIP, receptor interacting protein) связывается с TRAF2 (TNF receptor associated factor); TRAF2 вызывает фосфорилирование белка-ингибитора, с которым связан NF-kB; NF-kB перемещается в ядро, где активирует гены, отвечающие в том числе за экспрессию антиапоптозных молекул.
Несмотря на то, что наиболее часто NF-kB рассматривается как ингибитор А, в некоторых клетках это соединение может выступать в качестве индуктора . Подобное его свойство объясняют регуляцией экспрессии широкого ряда активных веществ (про-воспалительных энзимов, цитокинов, хемокинов, иммунорецепторов, клеточных молекул адгезии) через прикрепление к определенным областям ДНК (kB-области). В частности, NF-kB способен активировать гены, кодирующие Fas и FasL, что может сенситизировать клетки .
В связи с вышесказанным важно отметить способность ряда НПВП (салицилаты) ингибировать активность NF-kB, приводимую в качестве объяснения их противоопухолевой активности (заболевания толстой кишки). При этом салицилаты блокируют NF-kB в достаточно больших дозах, превышающих противовоспалительные и способных оказывать токсический эффект . Указанное свойство среди всей группы НПВП носит неоднородный характер.
Помимо перечисленных соединений, индуцирующих А, в клетках существует механизм негативной регуляции этого процесса - эндогенные ингибиторы К (белки семьи IAP), подавляющие активность К 3 и 9 и структурные гомологи проксимальных К 8 и 10. К последним относится клеточный протеин, известный как FLIP (Flame, CASH, Casper, Clarp, MRIT, I-Flice or Usurpin), который способен угнетать активацию К 8 и 10 путем конкуренции за связь с FADD . Известно об образовании двух вариантов FLIP, один из которых по размерам меньше (FLIPS) другого (FLIPl). Общим свойством обоих FLIP является наличие в структуре DED, который конкурирует с DED проК 8 за связь с FADD. Прочие особенности строения определяют конечный результат: только FLIPS и очень высокий уровень FLIPl ингибируют А, индуцированный рецепторами смерти, в то время как низкий уровень FLIPl обеспечивает активацию К 8 .
Отдельно рассматривается группа ингибиторов мембранорецепторного А - ложных рецепторов (decoy receptors), которые схожи по структуре с нормальными апоптозными рецепторами (Fas, TRAIL), но отличаются от них делецией какого-либо домена.
Необратимо связываясь с соответствующими лигандами, они блокируют передачу сигнала к гибели клетки .
Описанный рецепторный путь клеточной гибели является более коротким, чем другой путь - опосредованный митохондриями , но функционально оба они тесно связаны друг с другом.
Семейство Bcl-2 и митохондриальный путь
активации апоптоза
Митохондриальный путь А инициируется повреждением ДНК или воздействием цитотоксических агентов, что характеризует патологически измененные клетки . Важнейшим сенсором повреждения ДНК является ген р53 («страж генома»), который располагается в коротком плече 17 хромосомы, кодирует образование ядерного белка из 393 аминокислот АК (масса 53кД). Белок р53 находится в латентном состоянии и активируется не только в ответ на повреждение ДНК, но и вследствие гипоксии, активации онкогенов или воздействия других цитотоксических агентов . Роль гена р53 в гибели измененной клетки доказывается наличием его мутации примерно в 50 % опухолей человека . При активации р53 помимо прекращения клеточного деления инициирует А несколькими путями: активация генов Вах или Bid ; активация образования свободных форм кислорода (гены группы PIG3 (p-53-induced gene 3)), способствующих выходу цитохрома С из митохондрий ; индуцирует мРНК Fas, а также перемещение Fas на поверхность клетки из аппарата Гольджи ; стимулирует образование APAF-1 ; стимулирует экспрессию К 6 ; переход части молекул самого р53 в митохондрии с последующим выходом цитохрома С (Bcl-2 предотвращал эти эффекты) .
Важнейшим среди перечисленных является включение проапоптотических соединений семейства Bcl-2. Bcl-2 впервые описан как онкоген при В-клеточной лимфоме, приводящий к образованию опухолевого клона за счет увеличения выживаемости опухолевых клеток. В настоящее время семейство Bcl-2 объединяет группу белков (около 20 соединений) со сходным морфологическим составом, в котором существует по крайней мере одна из четырех консервативных аминокислотных последовательностей, характерных для В^2 (BH, Bcl-2 homology domain) . Функциональное значение этих регионов (ВН1-ВН4) пока окончательно не ясно . Семейство белков разделяется на две группы :
Ицдукторы апоптоза: Bim, Bad, Bid - BH-3; «multi-BН domain» (Bax, Bak, Bok) - ВН-1, BH-2, BH-3.
Ингибиторы апоптоза: Bcl-2, Bcl-w, А1 - ВН-1, ВН-2, ВН-3, ВН-4; Mcl-1, Bcl-xL - ВН-1, BH-2, BH-3.
ВН-3 белки являются первичными инициаторами
А, находясь в прямом антагонизме с антиапоптозными соединениями семейства Bcl-2 . Предполагаемые
модели взаимодействия фракций Bcl-2 семейства различны, а решение о гибели клетки принимается на основании относительного преобладания активных супрессоров или промоторов А .
Предполагаемые модели взаимодействия фракций Bcl-2:
1) Bcl-2 секвестрирует BH-3 лиганды Bax/Bak, предупреждая активацию А;
2) ВН-3 белки действуют на Вс1-2 и уменьшают их ингибирующее влияние на Вах;
3) отдельные ВН-3 белки активируют Вах, другие инактивируют Вс1-2 и посредством этого уменьшают ингибирующее влияние на проапоптоти-ческие белки .
Проапоптотические белки группы Bcl-2 имеют СООН-концевой гидрофобный регион, ответственный за прикрепление к мембранам органелл, в том числе к наружной поверхности митохондриальной мембраны в местах сближения наружной и внутренней мембран, где существуют физиологические поры (мегаканалы) (канал для Са, вольтажа, рН, активных форм кислорода), непроходимые в норме для цитохрома С. Белки Bcl-2 (Bax, Bak и др.) временно образуют более крупные мегаканалы, по которым в цитоплазму поступают цитохром С и другие факторы А .
Следствием раскрытия пор может быть и набухание матрикса с растяжением им внутренней митохондриальной мембраны, которая имеет большую поверхностную зону, чем наружная, вследствие чего возникают разрывы наружной мембраны и высвобождается цитохрома С . При всех указанных процессах митохондрия не теряет целостности и не подвергается разрушению.
Цитохром С представляет собой белок с молекулярной массой 15кД, кодируется ядерным геномом, импортируется в митохондрию, где прикрепляется к внутренней поверхности мембраны. Цитохром С необходим для образования апоптосомы, в которой активируется К 9 .
Стрессовый путь А активирует К 9 через комплекс Apaf-1 (apoptic protease activating factor, апоптотический протеаза-активирующий фактор). Конформационные изменения Apaf-1, индуцированные цитохромом С из поврежденных митохондрий и АТФ, позволяют привлечь проК 9 через их общий домен CARDs (caspase recruiment domain) . К 9 апоптосомы, в свою очередь, вызывает активацию эффекторных К (К 3, 7), которые инициируют интенсивный протеолиз и высвобождают связанную ДНКазу (CAD/DFF40), разрушающую хроматин .
К прочим митохондриальным факторам А, расположенным в межмембранном пространстве, относят:
Фактор, индуцирующий А (AIF, apoptosis-induc-ting factor, каспазонезависимая клеточная смерть): активирует нуклеазу, расщепляющую ядерную ДНК ; степень участия требует уточнения (все случаи фрагментации хроматина сопровождались активностью CAD) .
Второй митохондриальный фактор, активирующий А (Diablo/Smac): связывается с ингибиторами белков, активирующих А (IAP).
Термолабильный белок, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантинок-сидазу: ксантиндегидрогеназа в норме катализирует NAD + окисление ксантина до гипоксантина и превращение его в мочевую кислоту; ксантиноксидаза обеспечивает подобную реакцию с образованием агрессивных активных форм кислорода.
Особо следует отметить роль белка Bid, который является связующим звеном между двумя путями А - митохондриальным и путем «рецепторов смерти» (при воздействии К 8) .
Эндоплазматический ретикулум и его роль
в апоптозе
В настоящее время эндоплазматический ретикулум (ЭР) рассматривается как участник индуцированного стрессом А, что в значительной мере связывают с ролью ионов кальция. ЭР является самым большим хранилищем ионов кальция в клетке, их выход нередко сопровождается перемещением в митохондрии. Появляются доказательства влияния семейства Bcl-2 на ЭР подобно воздействию на митохондрии, демонстрируется участие Bax и Bak в мобилизации ионов кальция из депо ЭР . Непосредственное влияние обмена ионов кальция на активность К окончательно до настоящего времени не ясно.
На мембране ЭР локализована проК 12, в активации которой также предполагается участие белков семейства Bcl-2. Мышиные клетки с дефицитом К 12 оказались частично резистентными к А, индуцированному ЭР-стрессом, но по-прежнему чувствительными к другим стимулам клеточной гибели. Отмечено опосредованное активирующее влияние К 12 на К 3 .
Другие индукторы апоптоза
Необходимо упомянуть еще один механизм реализации А, происходящий нередко с участием цитоток-сических лейкоцитов. В основе механизма экспозиция на поверхности клетки фосфотидилсерина - фосфолипида, который обычно присутствует только во внутреннем липидном слое плазматической мембраны. Его окисление посредством активных форм кислорода ведет к тому, что особая транспортная АТФаза не узнает фосфолипид и переносит его на внешнюю мембрану. По-видимому, существует специальный рецептор, обнаруживающий фосфатидилсерин в наружном липидном слое и запускающий внутрь клетки сигнал А.
Клетка с фосфатидилсерином во внешнем слое клеточной мембраны узнается лейкоцитами, которые начинают выделять вблизи клетки-мишени белки. Полимеры белка перфорина образуют в цитоплазматической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, через которые внутрь поступают гранзимы (смесь сериновых протеаз) , способные запускать А через превращение проК 3 в К 3.
Кроме того, отмечено, что лейкоциты способны посредством специальной трансмембранной дыхательной цепи плазматической мембраны образовывать супероксиды и бомбардировать ими клетку-мишень, стимулируя А, в том числе через окисление фосфатидилсерина плазматической мембраны клетки-мишени.
Значение апоптоза в патогенезе и лечении
заболеваний
Актуальность изучения проблем А определяется взаимосвязью нарушения регуляции процесса запрограммированной гибели клетки с большинством заболеваний. Так, к заболеваниям, связанным с усилением А, относятся опухолевые заболевания: фолликулярная лимфома, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, аутоиммунные заболевания: системная красная волчанка, гломерулонефрит, вирусные инфекции, вызванные вирусом герпеса, аденовирусом, поксовирусами. К заболеваниям, ассоциированным с ингибированием А, относятся синдром приобретенного иммунодефицита, нейродегенеративные заболевания: болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, пигментный ретинит, хорея Ген-тингтона, мозжечковые дегенерации, апластическая анемия, токсические заболевания печени .
Изучение механизмов регуляции различных этапов А позволяет определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. В настоящее время общепринято: если клетка погибает от А, подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза - нет. На основе знаний о программированной клеточной гибели используется широкий ряд препаратов с целью регуляции этого процесса в различных типах клеток. Через индукцию А осуществляется действие большинства цитотоксических химиопрепаратов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов топоизомераз. С использованием андроген-блокирующей терапии лечат рак предстательной железы. Рак молочной железы часто подвергается регрессии при применении антагонистов эстрогеновых рецепторов .
В ближайшие годы можно ожидать появления новых лекарственных препаратов для лечения и предупреждения различных заболеваний, в основе действия которых будет заложен принцип регуляции процессов А. Многообещающими являются также подходы, связанные с регуляцией апоптоз-специфических генов и реализующиеся, в частности, в генной терапии - одной из самых перспективных областей современной медицины
При лечении заболеваний, вызванных нарушением функционирования отдельных генов.
Список литературы
1. Владимирская Е. Б. Механизмы апоптотической смерти клеток / Е. Б. Владимирская // Гематология и транс-фузиология. - 2002. - Т. 47, № 2. - С. 35-40.
2. Григорьев М. Ю. Апоптоз в норме и патологии / М. Ю. Григорьев, Е. Н. Имянитов, К. П. Хансон //
Медицинский академический журнал. - 2003. - Т. 3, № 3. - С. 3-11.
3. Залесский В. Н. Перспективы патогенетически обоснованного применения модуляторов апоптоза в качестве нейро-, кардио-, гепато- и нефропротекторов (обзор литературы) / В. Н. Залесский, А. А. Фильченков // http://www. medved.kiev.ua/arhiv_mg/st_2001/01_4_16.htm
4. Нагорнев В. А. Апоптоз и его роль в атерогенезе /
В. А. Нагорнев, А. Н. Восканьянц // Медицинский академический журнал. - 2003. - Т. 3, № 4. - С. 3-18.
5. Робинсон М. В. Апоптоз клеток иммунной системы / М. В. Робинсон, В. А. Труфакин // Успехи современной биологии. - 1991. - Т. 3, вып. 2. - С. 246-259.
6. Червякова Н. В. Fas/Fas-лиганд: маркеры апоптоза / Н. В. Червякова // Лаборатория. - 2004. - № 2.
7. Adams J. M. Ways of dying: multiple pathways to apop-tosis / J. M. Adams // Genes and Development. - 2003.
N 17. - P. 2481-2495.
8. Haupt S. Apoptosis - the p53 network / S. Haupt, M. Berger, Z. Goldberg, Y. Haupt // Journal of Cell Science.
2003. - N 116. - P 4077-4085.
9. Highton J. Cell death by apoptosis is a feature of the rheumatoid nodule / J. Highton, P. A. Hessian, A. Kean, M. Chin // Annals of the Rheumatic Diseases. - 2003. - N 62. - P 77-80.
10. Itoh K. Central role of mitochondria and p53 in Fas-mediated apoptosis of rheumatoid synovial fibroblasts / K. Itoh, H. Hase, H. Kojima et al. // Rheumatology. - 2004. - N 43. - P. 277-285.
11. Newton K. Caspases signal not only apoptosis but also antigen-induced activation in cells of the immune system / K. Newton, A. Strasser // Genes and Development. - 2003.
Vol. 17, N 7. - P 819-825.
12. Okamoto K. Fas-associated death domain protein is a Fas-mediated apoptosis modulator in synoviocytes / K. Okamoto, T. Kobayashi, T. Kobata et al. // Rheumatology.
2000. - N. 39 - P. 471-480.
13. Smith M. D. Apoptosis a relevant therapeutic target in rheumatoid arthritis? / M. D. Smith, J. G. Walker // Ibid.
2004. - N 43. - P. 405-407.
14. Smolewska E. Apoptosis of peripheral blood lymphocytes in patients with juvenile idiopathic arthritis / E. Smolewska, H. Brozik, P. Smolewski et al. // Annals of the Rheumatic Diseases. - 2003. - N 62. - P 761-763.
15. Tegeder I. Cyclooxygenase-independent actions of cyclooxygenase inhibitors / I. Tegeder, J. Pfeilschifter, G. Geisslinger // The FASEB Journal. - 2001. - N 15. - P 2057-2072.
16. Van den Berg J. M. Divergent effects of tumor necrosis factor- on apoptosis of human neutrophils / J. M. Van den Berg, S. Weyer, J. J. Weening et al. // Journal of Leukocyte Biology. - 2001. - N 69. - P 467-473.
APOPTOSIS: CONCEPT, MECHANISMS OF REALIZATION, SIGNIFICANCE
О. Yu. Varga, V. А. Ryabkov
State University, Petrozavodsk
In the article, the concept of apoptosis, a coded cell death, has been given, the present-day notions about mechanisms of its realization - the ways of «death receptors» typical for physiological processes, and the mitochondrial way of apoptosis activation typical for pathologic processes, main participants, role of endoplasmic reticulum, significance of apoptosis in biology and medicine have been shown.
Key words: apoptosis, coded cell death, cytokines, way of «death receptors», mitochondrial way.
1) Рецепторный. Осуществляется с помощью «рецепторов смерти» при активирующем взаимодействии с соответствующими лигандами, большинство из которых относится к суперсемейству фактора некроза опухолей. Взаимодействие рецептора с лигандом приводит к активации адапторных белков, ассоциированных с «доменами смерти» (FADD - Fas-associated death domain, TRADD - TNF-R-associated death domain), и прокаспазы 8, продукт которой - каспаза 8 (инициаторная) активирует каспазу 3 (эффекторную), что, в свою очередь, обусловливает активацию эндонуклеаз, фрагментирующих ДНК.
2) Митохондриальный. Участие митохондрий в апоптозе обеспечивается присутствием в их матриксе и межмембранном пространстве большого количества биологически активных веществ (цитохрома С (Cyt С); прокаспаз 2, 3, 9; апоптозиндуцирующего фактора (AIF), обладающих выраженным апоптогенным действием. Фактором активации апоптоза является выход данных веществ в цитоплазму при снижении трансмембранного потенциала митохондрий вследствие открытия гигантских митохондриальных пор (выполняют роль Ca 2 +-, рН-, потенциал-, НАДФ2Н/НАДФ+- и редоксзависимых каналов) и повышения проницаемости митохондриальных мембран. К раскрытию пор приводят истощение в клетках восстановленного глутатиона, НАДФН, АТФ и АДФ, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорилирования, увеличение содержания Ca 2 + в цитоплазме. Поступление межмембранных белков и активация апоптоза возможны также при разрыве наружной мембраны митохондрий вследствие гиперполяризации внутренней мембраны.
3) р53-опосредованный. p53 - многофункциональный белок, играющий важную роль в мониторинге сигналов о состоянии клетки, целостности ее генома, активности систем ДНК-репарации. Повреждение ДНК ведет к накоплению белка р53 в клетке. Это определяет остановку клеточного цикла в фазах G 1 и G 2 , предотвращает репликацию, активирует синтез и репарацию ДНК, а следовательно, создает условия для восстановления нативной структуры ДНК, препятствует появлению мутантных и анеуплоидных клеток в организме. В случае если имеется недостаточность систем ДНК-репарации и повреждения ДНК сохраняются, клетка подвергается апоптозу. В частности, белок р53 способен индуцировать транскрипцию таких апоптогенных факторов, как Bax, Fas- рецептор, DR-5 и др.
4) Перфорин-гранзимовый. Цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры) вызывают апоптоз клеток-мишеней (например, инфицированных клеток) с помощью белка перфорина. Полимеризуясь, перфорин образует в цитоплазматической мембране клеткимишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки поступают секретируемые Т-киллером гранзимы (фрагментины) - смесь сериновых протеаз. Основным компонентом этой смеси является гранзим В - протеолитический фермент, активирующий каспазу 3.
Значение белков-регуляторов апоптоза в развитии организма и патологических процессах
Вcl-2 требуется для поддержания жизнеспособности лимфоцитов, меланоцитов, эпителия кишечника и клеток почек во время развития эмбриона.
Вcl-x необходим для ингибирования смерти клеток в эмбриогенезе, особенно в нервной системе.
Bax необходим для апоптоза тимоцитов и поддержания жизнеспособности сперматозоидов во время их развития.
р53 является геном супрессии опухолей, поэтому в эмбриогенезе особой роли не играет, но обязательно необходим для супрессии опухолевого роста.
Усиленный синтез белка, кодируемого bcl-2 геном, приводит к подавлению апоптоза и, соответственно, развитию опухолей; данный феномен обнаружен в клетках В-клеточной фолликулярной лимфомы.
При лимфопролиферативных заболеваниях и похожей на системную красную волчанку болезни у мышей наблюдается нарушение функции Fas-лиганда или Fas-рецептора.
Повышенный синтез Fas-лиганда предупреждает отторжение трансплантата.
Апоптоз является частью патологического процесса при инфицировании клетки аденовирусами, бакуловирусами, ВИЧ и вирусами гриппа.
Ингибирование апоптоза в клетке-хозяине наблюдается при персистировании инфекции, в латентном периоде, а при усиленной репликации аденовирусов, бакуловирусов, возможно герпесвирусов, вируса Эпштейн-Барра и ВИЧ наблюдается активация апоптоза в клетках иммунной системы, что способствует распространению вируса.
Апоптоз
- запрограммированная гибель клетки в ответ на внешние или внутренние сигналы. Апоптоз происходит во время нормального развития, но может быть результатом рака, ВИЧ, болезни Альцгеймера.Распространенность в природе
Во время нормального развития организма апоптоз возникает в клетках при формировании формы или структуры органа. Например при образовании конечности мыши некоторые клетки подвергаются апоптозу и образуются пальцы.
Апоптоз во время нормального развития конечности мыши. Клетки подвергшиеся апоптозу (слева) мечены желтым. Та же конечность (справа) через один день.
Интересно, что некоторые птицы, такие как утка, имеют перепонки между пальцами, тогда как у других птиц, таких как курица, перепонок нет. В раннем эмбриогенезе и курицы и утки имеют перепонки между пальцами. Специфический белок BMP4 образуется в клетках между пальцами, запуская клеточную смерть этих клеток. Другой белок BMP (gremlin) образуется вокруг пальцев у обоих птиц и только у уток образуется также и в клетках перепонок, предотвращая запуск апоптоза в них.
Если добавлять белок gremlin в перепонку эмбрионов курицы, то она не подвергается апоптозу и сохраняется.
Слева лапка курицы после добавления в перепонку белка Gremlin (перепонка сохранилась), справа контрольный эксперимент без добавления белка (перепонка подверглась апоптозу).
Другим примером апоптоза в нормальном развитии является метаморфоз головастика лягушки. Под воздействием тиреоидного гормона при метаморфозе головастика лягушки, запускается апоптоз и хвост головастика исчезает. 
Пути апоптоза в клетке
Существуют два основных пути апоптоза в клетке:митохондриальный путь и путь через рецепторы апоптоза (смерти).
1. Рецепторы апоптоза
- семейства белков CD95 (Apo-1 или Fas) и TNF-R (фактор опухолевого некроза). TNF-альфа высоко цитотоксичная молекула, использовалась как лекарство против рака. TNF-R1 рецептор широко распространен и поэтому не может быть избирательным. Другие представители этого семейства (не все) имеют домен клеточной смерти (DD) - домен белок-белкового взаимодействия связывающийся с белком адаптором, таким как FADD. Активация рецепторов апоптоза лигандами (например, CD-95L и TNF-альфа приводит к активации каспазы-8, запуская каскад реакций ведущих к апоптозу.
2. Митохондриальный путь
. Митохондрии выполняют центральную роль в апоптозе, при этом наблюдается увеличение проницаемости митохондриальной мембраны. Баланс между про- и анти-апоптозных членов семейства Bcl-2 регулирует выход про-апоптозных веществ из митохондрий, ведущих к запуску апоптоза, таких как AIF, эндонуклеаза G, Smac/DIABLO и цитохром C. Утечка цитохрома-С из митохондрии приводит к образованию апоптосомы в цитоплазме, которая активирует каспазу-9 и запускает клеточную смерть.
Оба пути приводят к активации каспаз и запуску каскада реакций приводящих к гибели клетки.
Каспазы
Каспазы
(caspase) - ферменты расщепляющие белки по остаткам аспартата. Они содержат цистеиновые остатки на своих активных центрах. Многие изоформы каспаз ведут к апоптозу. Они могут быть активированы двумя путями: через рецепторы апоптоза и митохондрии.
Первая открытая каспаза - Ced-3 (Cell Death-3), обнаруженная у нематоды C. elegans. Мутация Ced-3 предотвращала гибель 131 клетки в процессе нормального развития нематоды. Гомолог Ced-3 у млекопитающих - интерлейкин-1альфа-преобразующий фермент (ICE) и был позже назван ингибитор каспазы-1.
Каскад активации каспаз
Известно 14 каспаз, которые подразделяются на инициаторы, эффекторы и стимуляторы. Инициаторы (каспаза-8 и -9) расщепляют и активируют каспазы эффекторы (каспаза-3). Эффекторы расщепляют различные белки, что ведет к гибели клетки. Активация каспаз ведет к запуску протеолитического каскада реакций ведущих к гибели клетки. При этом одни каспазы активируют другие - амплификация сигнала.
Каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух больших (~20kDa) и двух малых субъединиц (~10kDa). Большая и малая субъединицы образуется в результате расщепления прокаспазы. Каспаза содержат два активных центра QACXG. Ингибирующий домен (DED или CARD) может быть вырезан из каспазы.
Эффекторные каспазы активируются другими каспазами (трансактивация). Инициаторные каспазы активируются автоактивацией, которая происходит при взаимодействии нескольких прокаспаз (например, прокаспаза-8 и DISC). Рецептор апоптоза сам по себе не обладает протеазной активностью.
Активация каспаз ведет к различным последствиям:
каспаза-9 разрушает ядерные поры, что ведет к проникновению в ядро каспаз-3 и -7. Каспаза-3 расщепляет ингибирующую субъединицу ICAD в двух местах. Выпуск CAD приводит к расщеплению ДНК между нуклеосомами.
Каспазы ведут к реорганизации цитоскелета и распаду клетки на апаптозные тельца.
Каспазы
- семейство цистеиновых протеиназ, главные эффекторы апоптоза, существуют в клетке как неактивные проформы и зимогены, которые расщепляются на активные формы ферментов, активируя апоптоз.
Лиганд-->рецептор смерти-->активация инициаторов каспаз (каспаза-8, -10)-->каскад активации других каспаз>активация каспаз-3, -6-->инактивация клеточных структур.
Разрушение клеточных структур при апоптозе
Фрагментация хромосомной ДНК неактивный фермент CAD в комплексе с ICAD (ингибитор CAD-фактор фрагментации ДНК) расщепляется каспазой-3 высвобождая CAD, кот разрезает ДНК м-у нуклеосомами
Инактивация ферментов вовлеченных в репарацию ДНК - фермент поли (ADF-ribose) полимераза, или PARP- первый белок обнаруженный как субстрат для каспаз. PARP вовлекается в репарацию ДНК и катализирует синтез (ADF-ribose) и закрепляет на цепи ДНК ломая и изменяя ядерные белки. Способность PARP репарировать разрушения ДНК предотвращается последующим расщеплением PARP каспазой-3
Инактивация белков вовлеченных в репликацию. Каспазы могут инактивировать ДНК топоизомеразу II, способствуя разрушению ДНК.
Разрушение структурных ядерных белков. Каспаза-6 разрушает ламины разрушая ядро, что приводит к конденсации хромосом.
Чувствительность клеток к стимулам изменяется в зависимости от экспрессии про- и анти-апоптозных белков (Bcl-2 белок ингибитора), серьезности стумулов и стадии клеточного цикла
Распад клетки на везикулы, переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, уменьшение объема клетки, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация ядра (апоптозные тельца), фагоцитирующиеся макрофагами и клетками-соседями.
Инициаторы апоптоза
внешние сигналы (связывание лиганда индуцирующего смерть рецептором на клеточной пов-ти), быстрый вариант а
гранзим B может доставляться в клетки цитотоксичными T лимфоцитами, когда они узнают инфицированную клетку, активирует каспазы-3, 7, 8 и 10.
клеточный стресс
– радиация, химикалии, вирусная инфекции, недостаток фактора роста, ox стресс | кол-во bcl-2 белков определяет кол-во стресса необходимого для запуска а. Если митохондрии не справляются с удалением активных форм O2, последнии инициируют открытие пор во внеш. м-не и выход в цитозоль белка, ответственного за каскад реакций, ведущих к синтезу протеаз, нуклеаз
Митохондрия может быть ключевым регулятором каспазного каскада и апоптоза - избавление от цитохрома С в митохондрии может вести к активации каспазы 9 и затем каспазы 3. Этот эффект достигается через образование апоптосомы – мультипротеинового комплекса включающего цитохром C, Apaf-1, прокаспазу 9 и АТФ
Апоптосома
Цитохром C освобождается из митохондрий, связываясь с цитозольным белком Apaf-1. Это взаимодействие изменяет конформацию Apaf-1 которая стабилизируется связыванием ATP позволяя молекулам Apaf-1 ассоциировать друг с другом в колесоподобный комплекс состоящий из 7 молекул. Apaf-1, цитохром C и ATP - апоптосома, присоединяющая 7 молекул прокаспаз-9. Возможные механизмы:
1. Apaf-1, цитохром C и прокаспаза-9 – комплекс может активировать цитозольную прокаспазу-9 входящую в апоптосому.
2. Две апоптосомы взаимодействуют друг с другом активируя прокаспазу-9.
Оксид азота NO ингибирует апоптоз в лейкоцитах, гепатоцитах, трофобластах и эндотелиальных клетках. Эффект может быть вызван через нитрозилирование и инактивацию каспаз-3, -1, -8. NO взаимодействует с гемом гуанилат циклазы-->синтез сGMP-->активация cGMP-зависимой протеинкиназы-->экспрессия противоапоптозных белков.
bcl-2 - семейство белков
bcl-2 - семейство белков регуляторы апоптоза (bc-2, bcl-XL – противоапоптозные), (Bad, Bax – проапоптозные) | чувствительность клеток к апоптозным стимулам может зависеть от баланса противо- и проапоптозных bc-2 белков | стресс?проапоптозные bc-2 белки перемещаются на пов-ть митох, инактивируя антиапоптозные белки, что приводит к образ пор в митох и выпуск цитохрома с и др про-апоптозных молекул из межм-ного пр-ва-->формируется апоптосома-->активация каспазового каскада.
Проапоптозные члены Bcl-2 увеличивают проницаемость митохондриальной мембраны, что ведет к попаданию проапоптозных белков в цитоплазму. Противоапоптозные представители семейства - уменьшают проницаемость.
Bcl-2 разделяется на три субсемейства.
Bcl-2 субсемейство включает Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w, являющиеся противоапоптозными.
Bax субсемейство включает Bax, Bak и BAD, являющиеся проапоптозными белками. Их последовательности гомологичны регионам Bcl-2 субсемейства - BH1, BH2 и BH3, но не региону BH4.
BH3 субсемейство с единственным представителем - Bid, у которого гомологичен только BH3 регион.У Bid так же отсутствует трансмембранный домен.
Имеется несколько моделей, как Bcl-2 могут регулировать проницаемость митохондриальной мембраны.
Члены Bcl-2 семейства способны формировать гомо- и гетеродимеры. Гетеродимеризация между про- и противо-апоптозными представителями Bcl-2 ингибирует про-апоптозный белок.
Bcl-2 белки так же способны образовывать ионные каналы (Bcl-xL, Bcl-2 и Bax).
По другому механизму Bcl-2 образуют поры в митохондриальной мембране, осуществляющие неспецифический транспорт небольших молекул меньше 1.5kDa, что нарушает синтез ATP и ведеит к клеточной смерти. Так же цитохром-С и AIF могут выходить в цитоплазму и образовывать апоптосомуt. Bax и Bak - индуцируют выход цитохрома-С и AIF из митохондрий.
Сокращения.
DD - death domain
Caspases - (cysteinyl aspartate-specific proteases)
ICE - interleicin converting enzime
Стадии апоптоза
Различают три физиологические фазы апоптоза:
1. Сигнальная (активация специализированных рецепторов).
Инициация апоптоза может происходить посредством внешних (внеклеточных) или внутриклеточных факторов. Например, в результате гипоксии, гипероксии, субнекротического поражения химическими или физическими агентами, перекрёстного связывания соответствующих рецепторов, нарушения сигналов клеточного цикла, удаления факторов роста и метаболизма и т.д. Несмотря на разнообразие инициирующих факторов, выделяются два основных пути передачи сигнала апоптоза: рецептор-зависимый (внешний) сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный (собственный) путь.
Рецептор-зависимый сигнальный путь
Процесс апоптоза часто (например, у млекопитающих) начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов (англ. tumor necrosis factor receptor или кратко TNFR - «рецептор фактора некроза опухолей»). Наиболее изученными рецепторами смерти, для которых описана и определена роль в апоптозе, являются CD95 (также известный как Fas или APO-1) и TNFR1 (также называемый p55 или CD120a). К дополнительным относятся CARI, DR3 (англ. death receptor 3 - «рецептор смерти 3»), DR4 и DR5.
Все рецепторы смерти представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом смерти (англ. death domain или кратко DD) и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза. Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримерами лигандов (CD95L, TNF, Apo3L, Apo2L и т.п.). Тримеры лигандов в результате взаимодействия тримеризуют рецепторы смерти (то есть «сшивают» 3 молекулы рецептора). Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером (или адаптерами). Для рецептора CD95 (Fas/APO-1) адаптером является FADD (от англ. Fas-associated DD-protein - «белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора»). Для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (от англ. TNFR1-associated DD-protein - «белок, взаимодействующий с доменом смерти TNFR1-рецептора»).
Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами - пока ещё неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз - с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами, апоптозными шаперонами или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (от англ. DISC - death-inducing signaling complex - «сигнальный комплекс, индуцирующий смерть»). Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8.
Рецепторы смерти, адаптеры и эффекторы взаимодействуют между собой сходными по структуре доменами: DD, DED, CARD. DD (от англ. death domain - «домен смерти») участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED (от англ. death-effector domain - «домен эффектора смерти») осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами?8 и?10. Домен CARD (от англ. caspase activation and recruitment domain - «домен активации и рекрутирования каспазы») участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2.
Посредством рецепторов смерти могут быть активированы три инициирующие каспазы: ?2; ?8 и?10. Активированные инициирующие каспазы далее участвуют в активации эффекторных каспаз.
Митохондриальный сигнальный путь
Большинство форм апоптоза у позвоночных реализуется по митохондриальному пути, а не через рецепторы клеточной гибели. Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки. Высвобождение апоптогенных белков, предположительно, может осуществляться двумя путями: за счёт разрыва митохондриальной мембраны или же путём открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.
Ключевым событием митохондриального пути апоптоза является повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий (англ. Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization, MOMP). Существенную роль в повышении MOMP играют апоптотические Bcl-2 белки - Bax и Bak. Они встраиваются в наружную мембрану митохондрий и олигомеризуются. При этом, вероятно, нарушается целостность внешней мембраны митохондрий, по неизвестному пока механизму. При повышении MOMP из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль высвобождаются растворимые белки, участвующие в апоптозе: цитохром c - белок с молекулярной массой 15 кДа; прокаспазы?2, ?3 и?9; AIF (от англ. apoptosis inducing factor - «фактор индуцирующий апоптоз») - флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа.
Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объема митохондриального матрикса. Данный процесс связывают с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала и высокоамплитудному набуханию митохондрий вследствие осмотического дисбаланса. Поры диаметром 2,6-2,9 нм способны пропускать низкомолекулярные вещества массой до 1,5 кДа. Раскрытие пор стимулируют следующие факторы: неорганический фосфат; каспазы; SH-реагенты; истощение клеток восстановленным глутатионом; образование активных форм кислорода; разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличение содержания Ca 2+ в цитоплазме; воздействие церамида; истощение митохондриального пула АТФ и др.
Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком APAF-1 (от англ. Apoptosis Protease Activating Factor-1 - «активирующий фактор апоптотической протеазы-1»). Предварительно, APAF-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. Предполагается, что трансформированный APAF-1 приобретает способность связывать цитохром c . К тому же открывается доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9. В итоге происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка APAF-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.
2. Эффекторная (т.е. формирование из разнородных эффекторных сигналов единого пути апоптоза, и запуск каскада сложных биохимических реакций).
В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один (или несколько) общий путь апоптоза. Как правило, происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков-модуляторов. Основными эффекторами апоптоза являются каспазы. В процессе активации они запускают каспазный каскад: сложно переплетённые цепочки взаимодействий инициирующих и эффекторных каспаз:
Помимо каспаз существуют и другие эффекторы апоптоза. Например, флавопротеин AIF, высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий, действует по независимому от каспаз пути. Попадая в клеточное ядро, AIF вызывает конденсацию хроматина и активирует эндонуклеазы, которые участвуют в фрагментации ДНК. На основании экспериментальных данных установлено, что апоптоз, протекающий в присутствии AIF, не предотвращается ингибитором каспаз. В качестве эффекторов апоптоза также рассматриваются кальпаины - представители семейства цитозольных Ca 2+ -активируемых цистеиновых протеаз. Их роль в апоптозе пока слабо охарактеризована.
3. Деградационная (фаза экзекуции или деструкции).
Условно деградацию погибающей клетки можно разделить на три последовательных фазы: высвобождения, блеббинга и конденсации. Деградация большинства клеток начинается с высвобождения прикреплений внеклеточного матрикса и реорганизации фокальной адгезии. Внутри погибающей клетки деполимеризуются микротрубочки цитоскелета. Внутриклеточные актиновые микрофиламенты реорганизуются в связанные с мембраной периферийные (кортикальные) кольцевые пучки. В итоге клетка приобретает округлую форму. Следующая за высвобождением, стадия блеббинга, характеризуется сокращением периферийных актиновых колец. В результате сокращений клеточная мембрана образует вздутия, клетка как бы «кипит». Процесс блеббинга энергозависим и требует большого количества АТФ. Фаза блеббинга в нормальных условиях завершается примерно через час. В итоге клетка фрагментируется на маленькие апоптотические тела, либо целиком конденсируется, округляясь и уменьшаясь в размерах.
Роль белка р53
В нормальных клетках белок p53, как правило, находится в неактивной, латентной форме. Активация p53 происходит в ответ на повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым или гамма-излучением, гиперэкспрессией онкогенов, вирусной инфекцией, оксидативным стрессом, гипо- и гипертермией и др. Активированный p53 координирует процесс репарации ДНК, а также регулирует транскрипцию ряда генов-активаторов апоптоза в случае необратимых повреждений ДНК или нарушений регуляции клеточного цикла. К тому же имеются указания на то, что p53 принимает участие в запуске апоптоза путём стимуляции рецепторов смерти, путём взаимодействия с промотором апоптоза - Bax, путём активации p53-зависимого модулятора апоптоза PUMA (англ. p53 upregulated modulator of apoptosis), который блокирует действие Bcl-2. Повышение уровня p53 в ответ на повреждения ДНК вызывает апоптоз, например, в клетках кожи, в тимоцитах, в клетках кишечного эпителия.
